CRISPR) este o tehnică de editare a genomului de a treia generație: CRISPR a revoluționat lumea

Repetarea palindromică scurtă, grupată regulat intercalatată (CRISPR) este o tehnică de editare a genomului de a treia generație care a revoluționat lumea prin rezultatele sale de randament ridicat. A fost utilizată pentru a trata diverse boli biologice și infecții. Diverse bacterii și alte procariote (cum arhea) au, de asemenea, sisteme CRISPR/Cas9 pentru a se apăra împotriva fagilor. S-a raportat că strategiile bazate pe CRISPR/Cas9 pot inhiba creșterea și progresia cancerului de sân triplu negativ (TNBC) prin țintirea genelor de rezistență potențial alterate, a transcripției și a reglării epigenetice. Aceste intervenții terapeutice pot ajuta la abordarea problemelor dificile, cum ar fi rezistența la medicamente observată chiar și în TNBC. În prezent, se utilizează diverse metode pentru a administra CRISPR/Cas9 celulelor țintă, cum ar fi cele fizice (microinjecție, electroporare și moduri hidrodinamice), virale (virusuri adeno-asociate și lentivirusuri) și non-virale (lipozomi și nanoparticule lipidice). )-particule). Deși au fost dezvoltate diverse modele pentru a studia cauzele moleculare ale cancerului de țesut trigemin (TNBC), lipsa unor metode sensibile și țintite pentru furnizarea de instrumente de editare a genomului in vivo limitează aplicarea lor clinică. În concluzie, această analiză examinează în mod cuprinzător progresul, provocările, limitele și perspectivele tratamentului CRISPR/Cas9 pentru TNBC, pe baza dovezilor existente. De asemenea, evidențiem modul în care combinația dintre inteligența artificială și învățarea automată poate îmbunătăți strategiile CRISPR/Cas9 în tratamentul TNBC.
Cancerul este caracterizat prin diviziune celulară necontrolată, perturbarea punctelor de control ale ciclului celular și mutații ale genelor supresoare tumorale (TSG) (Matthews și colab., 2022). Printre diferitele tipuri de cancer, cancerul de sân este cel mai frecvent tip de cancer la femei și are o rată ridicată a mortalității la nivel mondial (Waks și Winer, 2019). Cancerul de sân este o boală eterogenă cu caracteristici diverse, cum ar fi caracteristicile histologice și biologice, tabloul și comportamentul clinic și răspunsul la tratament (Weigelt și colab., 2010). Clasificarea cancerului de sân oferă informații precise pentru diagnosticarea cancerului de sân și prognosticul tumorii. Utilizarea biomarkerilor comuni și a caracteristicilor clinicopatologice a fost principalul criteriu pentru clasificarea cancerului de sân (Tsang și Tse, 2019). Prognosticul și răspunsul la tratament al cancerului de sân sunt influențate de numeroși factori, inclusiv prezența receptorului de estrogen (ER), a receptorului de progesteron (PR), a receptorului 2 al factorului de creștere epidermal uman (HER2/neu) și gradul histologic, tipul și gradul tumorii. dimensiunea și metastazele ganglionilor limfatici (Al-Tubaiti, 2020). Au fost identificate cinci subtipuri moleculare intrinseci de cancer mamar, inclusiv luminal A, luminal B, îmbogățit cu HER2, bazal-like și claudin-low (Prat et al., 2015). Cancerul mamar tripla-like (TNBC) este un subtip molecular de cancer care nu exprimă toate ER, PR și HER2 (Yin et al., 2020). Aceste caracteristici patologice sunt asociate cu TNBC, confirmând progresia sa rapidă și natura mai agresivă decât orice alt tip de cancer mamar (Feng et al., 2018). În plus, Peru et al. (2000) au utilizat tehnologia microarray pentru a reclasifica cancerul mamar și a identifica cinci subtipuri intrinseci de cancer mamar (Cadenas, 2012). Cancerul mamar bazal-like este un subtip de cancer mamar care are un fenotip triplu-negativ și este asociat cu o progresie rapidă. Trebuie menționat că toate cancerele de sân de tip bazal sunt frecvent diagnosticate confundat cu cancer mamar trigeminal (CMTN), dar doar 77% sunt CMTN; În schimb, 71-91% din CMTN sunt de tip bazal, ceea ce indică faptul că aceste două tipuri de cancer mamar se suprapun și reprezintă clasificări diferite (Wang D.-Y. et al., 2019). Acest lucru creează necesitatea de a caracteriza eterogenitatea CMTN pentru a elucida prognosticul și a identifica potențialele răspunsuri la tratamentele actuale și viitoare. În plus, CMTN reprezintă 15-20% din toate cazurile de cancer mamar și este mai frecvent la femeile sub 50 de ani. Mutațiile BRCA1 sau BRCA2 au fost raportate în aproximativ 20% din cazurile de CMTN (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Studiile au arătat, de asemenea, că TNBC are un micromediu imunitar distinct, care include niveluri ridicate de factori de creștere endoteliali vasculari, macrofage asociate tumorii (TAM), limfocite care se infiltrează în tumoră (TIL) și alte molecule implicate în creșterea și migrarea tumorii. Prin urmare, înțelegerea micromediului TNBC este esențială pentru prognosticul și tratamentul său (Fan și He, 2022).
Pentru a evalua prognosticul cancerului de măduvă neagră (CMTN) și a asigura un tratament eficient, este important un diagnostic precis, bazat în principal pe imunohistochimie (IHC) pentru a detecta RE, PR și HER2, și mamografie pentru a detecta neoplasmele mamare. Cu toate acestea, mamografia nu poate descrie în mod adecvat caracteristicile intratumorale, cum ar fi necroza și fibroza (Deepak Singh și colab., 2021). Deoarece prognosticul și diagnosticul slabe împiedică medicii să prescrie medicamentele potrivite (Chaudhary, 2020), se utilizează diverse strategii pentru a îmbunătăți îngrijirea pacienților cu CMTN. În prezent, două medicamente, doxorubicina și ciclofosfamida, sunt utilizate la pacienții cu CMTN și au arătat rezultate bune. În plus, se utilizează și alte medicamente pe bază de platină, cum ar fi carboplatina și cisplatina (Sikov și colab., 2015). În plus, inhibitorii PARP, cum ar fi Olaparib, Velaparib și PF-01367338, au fost utilizați ca potențiale medicamente chimioterapice pentru tratamentul CMTN (Ishino și colab., 2018). Întrucât s-a raportat că căile de semnalizare Wnt/b-Catenin, NOTCH și Hedgehog sunt implicate în apariția și progresia carcinomului triclonal amiotrofic (TNBC), direcționarea medicamentelor către aceste căi poate fi o strategie importantă (Aysola et al., 2013). Deși chirurgia, radioterapia și chimioterapia rămân pilonul principal al tratamentului pentru TNBC în prezent, s-au înregistrat progrese semnificative în dezvoltarea de noi tratamente, inclusiv terapia țintită, imunoterapia, diverse instrumente de editare genică legate de CRISPR, cum ar fi Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, editarea inițială și terapia genică direcționată către CRISPR/Cas9. Aici ne vom concentra asupra diverselor instrumente de editare genică legate de CRISPR utilizate în tratamentul TNBC. Printre acestea, CRISPR/Cas9 a primit o atenție largă.
Cas9n, cunoscută și sub numele de Cas9 nickază, este o variantă modificată genetic a proteinei Cas9, derivată din sistemul de editare a genomului CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). În forma sa originală, proteina Cas9 conține două domenii nucleazice: RuvC și HNH, a căror funcție principală este scindarea ambelor catene de ADN. Cu toate acestea, în Cas9n, unul dintre domeniile nucleazice, HNH, este mutat genetic și devine inactiv. Prin urmare, domeniul HNH al Cas9n rămâne nefuncțional. Doar domeniul RuvC rămâne activ, permițând Cas9n să taie sau să creeze rupturi pe catene individuale de ADN (Trevino și Zhang, 2014). Comparativ cu Cas9, Cas9n poate reduce eficient efectele în afara țintei și poate îmbunătăți cu precizie mecanismele de reparare celulară. Cas9n poate fi utilizat pentru a rezolva diverse probleme, cum ar fi crearea de rupturi în locații specifice în ADN-ul bicatenar. În acest scop, două molecule Cas9n au fost combinate și utilizate împreună (Yee, 2016). Kinaza 3 de linie mixtă (MLK3) este o protein kinază activată de mitogeni care servește ca regulator cheie în timpul metastazelor TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 poate activa multiple căi de semnalizare care duc la metastaze în carcinomul trigeminal (TNBC). De exemplu, calea kinazei c-Jun N-terminale (JNK) reglează motilitatea celulară și degradarea matricei extracelulare, iar MLK3 activează calea JNK, sporind astfel motilitatea celulară și conferindu-i proprietăți invazive (Rattanasinchai și Gallo, 2016). MLK3 reglează, de asemenea, EMT. Pentru a face acest lucru, activează factorii de transcripție din aval, cum ar fi Snail, Slug și Twist. Acești factori inhibă expresia markerilor epiteliali și promovează expresia markerilor mezenchimali, ducând la dobândirea unui fenotip metastatic (Casalino et al., 2023). S-a observat că MLK3 joacă un rol în remodelarea ECM și activarea proteazelor, cum ar fi metaloproteinazele matriceale (MMP), care degradează ECM. Acest lucru facilitează invazia celulelor tumorale și răspândirea în locuri îndepărtate (Katari et al., 2019). Astfel, studiile anterioare au arătat că MLK3 joacă un rol critic în TNBC. Rattanasinchai și Gallo au folosit modele TNBC pentru a studia rolul MLK3 și au descoperit că aceasta promovează dezvoltarea cancerului prin căi de semnalizare specifice. Aceștia au folosit CRISPR/Cas9n pentru a edita MLK3 și au observat o reducere semnificativă a metastazelor TNBC (Rattanasinchai și Gallo, 2016).
dCas9, adesea numit Cas9 inactiv, este o formă derivată modificată a proteinei Cas9. Spre deosebire de Cas9 activ, dCas9 nu are activitate endonucleazică, ceea ce îl face incapabil să inducă rupturi dublu catenare ale ADN-ului. Prin urmare, dCas9 poate fi utilizat pentru a viza cu precizie regiuni specifice ale genomului fără nicio modificare a secvenței de ADN (Wang et al., 2016). În dCas9, două proteine ​​endonucleazice, RuvC și HNH, sunt inactivate prin suprimarea unor reziduuri importante de aminoacizi. (Richter et al., 2016). În ciuda lipsei sale de activitate de scindare a ADN-ului, dCas9 joacă o serie de roluri importante în cercetarea genetică și biotehnologie. De exemplu, permite vizualizarea unor regiuni specifice ale genomului, facilitează reglarea transcripțională și promovează modificări epigenetice (Brocken et al., 2018).
Factorul de transcripție ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) joacă un rol specific și critic în medierea tranziției epitelio-mezenchimale (TEM), un proces celular care are loc în timpul dezvoltării embrionare, reparării țesuturilor și progresiei cancerului. Aceasta implică transformarea celulelor epiteliale în celule mezenchimale, rezultând modificări ale morfologiei celulare, motilității, invazivității etc. (Wu et al., 2020). ZEB1 inhibă mai mulți markeri epiteliali, cum ar fi E-caderina și Occludina, care sunt responsabili pentru menținerea aderenței celulă-celulă și a polarității celulelor epiteliale în TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). În plus, ZEB1 activează anumiți markeri precum N-caderina, vimentina și fibronectina (Konradi et al., 2014) și reglează, de asemenea, genele implicate în remodelarea citoscheletului, cum ar fi Rho GTPazele și metaloproteinazele matriceale (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), în plus, afectează și diverse căi de semnalizare, cum ar fi factorul de creștere transformant-β (TGF-β), semnalizarea Wnt etc., promovând astfel invazia tumorală și metastaza în TNBC (Chen și colab., 2016). Numeroase studii și dovezi științifice indică faptul că ZEB1 are un mare potențial ca agent valoros pentru detectarea și intervenția terapeutică a TNBC. Într-un studiu recent, Waryah și colab. au utilizat un model TNBC și au obținut suprimarea completă a ZEB1 de către dCas9. Astfel, au observat o specificitate foarte mare și o inhibare aproape completă a ZEB1 în condiții in vivo (Waryah și colab., 2023).
CRISPR/Cas12 este un instrument de editare genetică numit CRISPR/Cpf1. Este derivat din sistemul CRISPR/Cas, unde termenul Cas12 se referă la proteina 12 asociată cu CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), care este complet similară cu Cas9. Singura diferență este că conține proteina Cas12. Comparativ cu Cas9, Cas12 are câteva funcții unice, cum ar fi generarea de capete lipicioase în timpul procesului de editare genetică, în timp ce Cas9 generează capete bonte (Wang et al., 2021). Această proprietate a Cas12 contribuie la tehnologia sa specifică de manipulare a ADN-ului. Fiind o proteină capabilă să recunoască și să taie cu precizie ADN-ul țintă, are o versatilitate extraordinară, ceea ce o face un instrument eficient pentru o varietate de aplicații, inclusiv editarea genetică (Pickar-Oliver și Gersbach, 2019).
Similar altor variante CRISPR, CRISPR/Cas12 este, de asemenea, capabil să elimine sau să activeze gene în TNBC, vizând gene care joacă un rol important în patogeneza sau răspunsul la tratament (Yang și Zhang, 2023). Pentru a realiza acest proces, a fost dezvoltat un ARN ghid (gARN) care direcționează Cas12 către gena țintă. Odată ce Cas12 se leagă de ținta sa, introduce rupturi dublu catenare în ADN și activează mecanismele de reparare a ADN-ului. În timpul procesului de reparare, pot fi încorporate nucleotide incorecte, ceea ce duce la mutații genetice și pierderea funcției (Zhang et al., 2021a). În plus, o versiune îmbunătățită a enzimei Cas12 (numită dCas12) a fost utilizată și pentru a activa genele. Prin combinarea acesteia cu un activator de transcripție, este posibilă inducerea anumitor gene, activându-le astfel. Această tehnologie are un mare potențial în promovarea activării genelor supresoare tumorale (Sultan et al., 2022).
Editarea primerilor este o tehnologie de editare a genomului recent dezvoltată și extrem de superioară. Este capabilă să modifice ADN-ul unui organism foarte precis (Chen și Liu, 2023). Editarea primerilor se realizează prin integrarea a două componente principale: o enzimă CRISPR/Cas9 modificată și o transcriptază inversă. Rolul enzimei CRISPR/Cas9 este de a viza selectiv situsuri precise din genom, în timp ce transcriptaza inversă ajută la modificarea completă a ADN-ului la locația țintă (Hassan și colab., 2021). În mecanismul de editare a primerilor, primul pas implică crearea unui ARN ghid de editare a primerilor (pegARN) (Standage-Beier și colab., 2021). Acesta conține secvența țintă și șablonul de ARN corespunzător situsului de editare dorit din ADN-ul țintă. PegARN-ul este apoi introdus în celulele țintă împreună cu o nuclează de editare a primerilor (PE2). PE2 este o proteină de fuziune constând dintr-o enzimă Cas9, o transcriptază inversă și un adaptor de editare a primerilor (Martín-Alonso și colab., 2021). În interiorul celulei, complexele pegRNA și PE2 caută ADN-ul specific pe care doresc să îl modifice. Enzima Cas9 taie ADN-ul și creează un șablon format din catene simple (Choi și colab., 2022). Transcriptaza inversă folosește acest șablon pentru a pregăti ADN-ul pentru editare. Pe lângă copierea ADN-ului, sunt incluse și instrucțiuni pentru editarea șablonului ARN. În cele din urmă, catena de ADN nou creată este utilizată ca șablon pentru a repara ruptura din ADN, rezultând o secvență de ADN modificată care conține modificarea dorită (Ochoa-Sanchez și colab., 2021). Mecanismele de editare cu primeri pot duce la mutații pe scară largă în gene. Poate viza mutații punctuale, inserții, deleții și chiar înlocuiri de gene (Anzalone și colab., 2019; Chen și Liu, 2023). Editarea cu primeri oferă mai multe avantaje față de tehnologiile anterioare de editare a genomului. Acestea includ o precizie sporită, efecte reduse în afara țintei și capacitatea de a edita ADN-ul fără a se baza pe rupturi duble catenare ale ADN-ului (Anzalone și colab., 2020).
Tehnologia CRISPR/Cas9 a fost dezvoltată inițial pentru a proteja bacteriile de transferul plasmidelor și infecția cu fagi și a fost ulterior reutilizată ca un instrument eficient de direcționare a ADN-ului bazat pe ARN pentru editarea genomului (Jiang și Doudna, 2017). În plus, s-a raportat că sistemul CRISPR/Cas9 este prezent în 50%, respectiv 87% din genomurile bacteriene și arheale (Ishino și colab., 2018). CRISPR/Cas9 este un instrument potențial pentru ștergerea, inserarea și corectarea oricărei secvențe genetice anormale utilizând moduri in vivo și in vitro (Sabit și colab., 2021). Mai mult, s-a demonstrat că CRISPR/Cas9 face parte din sistemul imunitar adaptiv datorită specificității sale pentru genele țintă de interes (Chen și Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 este alcătuit din Cas9 și un singur ARN ghid (sgARN). Cas9 este o endonuclează compusă din mai multe componente proteice. În plus, Cas9 are proprietăți structurale și conformaționale unice (Pacesa et al., 2022), deoarece este alcătuit din doi lobi: de recunoaștere (REC) și nuclează (NUC). Lobul REC este împărțit în continuare în trei regiuni: REC1, REC2 și helixuri de punte (Cromwell et al., 2018). NUC este alcătuit din trei lobi, și anume RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH și domeniul de interacțiune al motivului adiacent protospacer (PAM) (Fig. 1) (Song et al., 2016). sgARN este alcătuit din două componente, inclusiv ARN CRISPR (crARN) și ARN mic transcodant (ARN trasor) (Figura 1). ARN-ul simplu (sgARN) conectează proteina Cas9 la conexine pentru a forma un complex activ, cunoscut și sub numele de complex efector (Richter et al., 2012). ARN-ul cr este o pereche de baze de 18-20 de nucleotide care joacă un rol esențial în recunoașterea secvențelor de ADN țintă. În plus, ARN-ul cr se împerechează cu ADN-ul țintă, iar ARN-ul tracr acționează ca o schelă pentru nucleaza Cas9 pentru a se lega de ADN-ul țintă (Manghwar et al., 2019). Pe de altă parte, secvența PAM are 3 nucleotide, ceea ce confirmă, specifică și mediază legarea complexului efector la ADN. Subunitățile RuvC și HNH ale complexului proteic Cas9 au activitate catalitică (Richter et al., 2012; Asmamaw și Zawdie, 2021). Domeniul nucleazei HNH al subunității Cas9 scindează catena de ADN asociată cu ARN-ul cr. Domeniul nucleazic RuvC scindează alte catene de ADN și generează rupturi duble catenare (DSB), după care sunt activate două mecanisme diferite de reparare a rupturilor de ADN (Jiang și Doudna, 2017) (Figura 1).
Figura 1. Prezentare generală a CRISPR/Cas9 (A). Componentele sistemului CRISPR/Cas9: (i). Endonucleaza Cas9 este responsabilă pentru tăierea secvenței țintă de ADN, (ii) un singur ARN ghid (sg) rezultat din fuziunea himerelor crARN și tra-crARN. (două). Cas9 include mai multe componente, cum ar fi Rec I, Rec II, lobul NUC (HNH și Ruv C sunt subcomponente) și domeniul de interacțiune PAM (C) cu funcții corespunzătoare. Complexul proteic CRISPR/Cas9 scindează secvențele de ADN în forme necomplementare și complementare (D). CRISPR/Cas9 editează genomul în trei etape: recunoaștere, tăiere și reparare. ARN-ul sg proiectat ghidează Cas9 și recunoaște secvența dorită prin intermediul componentei complementare crARN. Cas9 recunoaște secvența PAM la 5′-NGG-3′ și topește ADN-ul, formând un hibrid ADN-ARN și activând scindarea. Domeniul HNH al Cas9 scindează catena complementară, iar domeniul RuvC scindează catena necomplementară. CRISPR/Cas9 repară ADN-ul bicatenar prin ruperea acestuia în două moduri: joncțiunea la capăt neomolog (NHEJ) și repararea direcționată prin omologie (HDR). NHEJ repară ADN-ul bicatenar în absența ADN-ului omolog străin printr-un proces enzimatic, un mecanism predispus la erori care poate insera sau elimina secvențe aleatorii de ADN. HDR este foarte specific și necesită șabloane de ADN omoloage.
Căile de reparare mediate de CRISPR/Cas9 includ mecanisme de joncțiune a capetelor neomoloage (NHEJ) și reparare direcționată prin omologie (HDR). NHEJ este o cale predispusă la erori, deoarece implică inserția sau ștergerea și nu necesită niciun model în timpul mecanismului de reparare. Folosește nucleotide aleatorii pentru a genera proteine ​​standard (Abbasi și colab., 2021). Acest sistem de reparare constă din patru complexe, cum ar fi complexul KU, complexul proteic de complementare încrucișată de tip 4 (XRCC-4), enzima de procesare a capetelor ADN și proteina kinaza ADN-PKcs (Abbasi și colab., 2021). Proteina complexă KU are două subunități, Ku 70 și Ku 80, și joacă un rol important în mecanismul NHEJ, deoarece mecanismul de reparare este inițiat prin legarea a două subunități (Ku 70 și Ku 80) la capetele obtuze sau aproape obtuze ale ADN-ului țintă (Abbasi și colab., 2021), servind ca schelă pentru recrutarea altor factori legați de NHEJ la locul leziunii (Yang și colab., 2020). XRCC-4 și ADN ligaza sunt compuse din 334 și respectiv 911 aminoacizi, iar complexul XRCC4-ADN ligază IV stimulează ligarea capetelor ADN (Chatterjee și colab., 2015). Enzima de procesare a capetelor ADN, cunoscută și sub numele de polinucleotid kinaza 3'-fosfat, este o enzimă de procesare a capetelor ADN. Aceasta poate elimina gruparea 3'P din ADN și fosforila gruparea 5'OH în timpul reparării DSB. De asemenea, implică repararea rupturilor monocatenare (SSB) utilizând calea de reparare SSB (Chatterjee și colab., 2015). Protein kinaza DNA-PKcs este o protein kinază dependentă de ADN care constă dintr-o subunitate catalitică a PIKK-urilor (kinaze legate de fosfatidilinozitol 3-kinaza) și a familiei de ataxie-telangiectazie mutate (ATM), precum și ATR-uri legate de ATM și Rad3. rupturi monocatenare (DSB) și rupturi monocatenare (Yue și colab., 2020; Peng și colab., 2016).
HDR este un mecanism de reparare mai precis și mai potrivit, deoarece informațiile sunt copiate folosind forma intactă a duplexului de ADN omolog, deși necesită prezența cromatidelor surori. Acest lucru se întâmplă în timpul fazei S/G2 a ciclului celular la mamifere. HDR apare în principal la speciile de drojdie, dar NHEJ este esențial la mamifere (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Mecanismul complet de reparare este prezentat în Figura 1.
Întrucât cancerul tumoral trigeminal (TNBC) este cauzat de anomalii genetice și epigenetice, corectarea anomaliilor genomice/epigenomice maligne utilizând CRISPR/Cas9 poate fi o abordare terapeutică rezonabilă (Chen et al., 2019). În plus, unii factori de transcripție implicați în reglarea transcripțională specifică celulelor pot prezenta caracteristici unice ale celulelor canceroase, sugerând că reglarea transcripțională poate fi o abordare excelentă pentru tratamentul cancerului (Drost et al., 2017). Exploatarea acestor caracteristici moleculare ale tumorilor, cum ar fi defectele genetice, epigenetice și transcripționale, pentru dezvoltarea de medicamente poate îmbunătăți rezultatele clinice și poate reduce costurile de screening. CRISPR este un instrument potențial de editare a genelor care nu numai că poate detecta și identifica țintele genomice care cauzează cancer, dar poate fi utilizat și pentru a edita, suprima și modifica epigenetic oncogenele din celulele umane (Tabelul 1) (Ahmed et al., 2021). Mai multe screening-uri CRISPR au fost efectuate pentru a căuta gene asociate cu supresoare tumorale, oncogene și rezistență la medicamente. Utilizarea CRISPR/Cas9 pentru editarea diferitelor oncogene ale TNBC este prezentată în Figura 2.
Figura 2. Editarea genetică a diferitelor oncogene ale cancerului de trigeminee tumorale (TNBC) utilizând CRISPR/Cas9, rezultând o reducere a creșterii tumorale și a metastazelor. Aceste oncogene includ CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 și CXCR7, Crypto1, ROR1 și ST8SIA, care sunt implicate în apariția și metastaza TNBC.
Migrarea, invazia și tranziția epitelio-mezenchimală (TEM) a celulelor canceroase sunt asociate cu ITGA9. Studiile anterioare au arătat că ITGA9 este un jucător cheie în calea Notch și joacă un rol interesant în metastazele rabdomiosarcomului (Molist et al., 2020). În plus, s-a constatat că ITGA9 este strâns asociat cu prognosticul pacienților în mai multe tipuri de tumori, inclusiv cancerul de sân (Wang Z. et al., 2019). În plus, analiza bioinformatică a ITGA9 a arătat că expresia sa în TNBC a fost semnificativ mai mare decât în ​​alte subtipuri de cancer de sân. Nivelurile crescute de ITGA9 sunt asociate cu metastaze tumorale și recidivă la pacienții cu TNBC. Eliminarea ITGA9 prin CRISPR/Cas9 a dus la proprietăți asemănătoare celulelor stem canceroase (CSC), angiogeneză tumorală, creștere tumorală și metastaze reduse prin promovarea degradării β-cateninei în TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 este un membru al familiei TGF-β și este esențial pentru embriogeneza timpurie, menținerea celulelor stem și metastazele canceroase (Ishii et al., 2021). Cunoscută și sub numele de Tdgf-1, este o proteină de semnalizare oncogenică ancorată în GPI, implicată în reglarea formării liniei primitive, mezodermului și endodermului, precum și în stabilirea asimetriei stânga/dreapta în dezvoltarea organelor corpului în timpul embriogenezei (Zhang et al., 2021b). În plus, s-a demonstrat că Cripto-1 este implicat în tranziția epitelio-mezenchimală (TEM) ca marker al celulelor stem (Zhang et al., 2021b). TEM este esențial nu numai pentru diverse procese, cum ar fi dezvoltarea embrionară, fibroza și vindecarea rănilor, ci și pentru invazia cancerului și metastaze. În plus, s-a demonstrat că Cripto-1 interacționează cu patru receptori Notch și le sporește maturarea post-translațională (Brandstadter și Maillard, 2019). Calea de semnalizare Notch este cunoscută ca fiind implicată în menținerea celulelor canceroase de sân umane. Studiile au arătat că eliminarea Crypto-1 mediată de CRISPR/Cas9 suprimă creșterea cancerului și metastazele. Prin urmare, Crypto-1 ar putea deveni o țintă terapeutică importantă pentru TNBC (Castro et al., 2015).
Proteina XCL12 și receptorul său chemokinic CXC (CXCR4 și CXCR7) joacă diverse roluri în proliferarea, creșterea, migrarea și invazia celulelor canceroase (Wu et al., 2015). Acești chemoreceptori au fost asociați cu dezvoltarea carcinomului trigeminal-tetraoid (TNBC) prin multiple căi de semnalizare atât în ​​modelele in vivo, cât și in vitro (Wu et al., 2015). În plus, activarea CXCR4 și CXCR7 este asociată cu o susceptibilitate mai mare la metastaze și un prognostic slab în TNBC (Karn et al., 2022). Prin urmare, eliminarea genelor CXCR4 și CXCR7 poate deveni o genă țintă eficientă pentru tratamentul cancerului de sân, inclusiv TNBC. Studiul realizat de Yang și colab. Yang și colab. (2019) au utilizat CRISPR/Cas9 pentru a co-inhiba genele CXCR4 și CXCR7 și au constatat că proliferarea, creșterea, migrarea și invazia TNBC au fost inhibate semnificativ (Yang et al., 2019).
Niveluri crescute de miR-3662, o oncogenă a celulelor canceroase mamar (TNBC), au fost observate în țesuturile canceroase de sân (Yi și colab., 2022). S-a demonstrat că reducerea miR-3662 inhibă creșterea și metastaza tumorii canceroase de sân atât in vivo, cât și in vitro (Agarwal și Gupta, 2021). HBP-1 este un inhibitor puternic al semnalizării Wnt/-catenină și este probabil responsabil pentru creșterea celulelor TNBC mediată de miR-3662. Recent, Yi și colab. au descoperit că axa miR-3662-HBP1 reglează calea de semnalizare Wnt/-catenină în celulele TNBC (Yi și colab., 2022). Datorită expresiei sale specifice tumorii, miR-3662 poate fi o țintă terapeutică potențială pentru TNBC. Astfel, reducerea miR-3662 mediată de CRISPR/Cas9 poate fi o abordare excelentă pentru dezvoltarea de noi medicamente pentru tratamentul TNBC.
UBR5 este o nucleofosfoproteină de 300 kDa identificată ca regulator cheie al tumorogenezei, metastazelor și răspunsului imun în diverse tipuri de cancer (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). S-a raportat că UBR5 este puternic suprareglat în probele de TNBC și stimulează funcția ERα prin inducerea proliferării prin activitatea sa ubiquitin ligazei (Bolt et al., 2015). Studiile de secvențiere a întregului exom al probelor primare de TNBC au arătat, de asemenea, o expresie crescută a UBR5, sugerând rolul său în dezvoltarea TNBC. În plus, deleția UBR5 determinată de CRISPR/Cas9 a demonstrat o inhibare semnificativă a metastazelor și creșterii TNBC în modelele experimentale de șoarece. Mai mult, includerea UBR5 într-un model de șoarece de tip sălbatic i-a restabilit funcționalitatea completă, în timp ce acest efect nu a fost observat în tulpinile mutante inactivate (Liao et al., 2017). Lipsa UBR5 este asociată cu creșterea apoptozei, necrozei și inhibării creșterii tumorale în carcinomul trigeminal (TNBC) din cauza angiogenezei deficitare. Din cauza pierderii UBR5, răspândirea tumorii la organele îndepărtate este redusă, iar UBR5 induce EMT anormală în principal prin reducerea expresiei E-caderinei (Zhang și Weinberg, 2018). Recent, s-a demonstrat că UBR5 este un factor foarte important în transcripția PDL1 indusă de IFN-γ în TNBC, datorită lipsei sale de activitate de ubiquitinare E3. Analiza transcriptomului ARN a relevat că UBR5 poate avea efecte sistemice asupra genelor asociate cu calea IFN-γ și poate promova transactivarea PDL1 prin creșterea nivelurilor de activare a ARN-ului protein kinazei (PKR) și a traductorilor și activatorilor săi de semnal. transcripția 1 (STAT1) și factorul de reglare a interferonului 1 (IRF1). Cu toate acestea, ablația combinată mediată de CRISPR/Cas9 a expresiei UBR5 și PD-L1 are un efect terapeutic sinergic mai mare decât oricare dintre blocade, cu efecte profunde asupra micromediului tumoral (Wu et al., 2022). Astfel, CRISPR/Cas9 poate fi un instrument important pentru inhibarea funcției UBR5, suprimând astfel metastazele TNBC și creșterea tumorii.
ROR1 este o proteină transmembranară de tip I care este exprimată în timpul cancerului și dezvoltării embrionare și a fost identificată ca o proteină oncofetală (Nicholas Borcherding, 2014). Comportamentul invaziv al diferitelor tipuri de cancer uman este asociat cu supraexprimarea ROR1. Rezultate promițătoare au fost obținute din studii in vivo și in vitro care au implicat compuși terapeutici care vizează ROR1 (Chien et al., 2016). Nivelurile crescute de ARNm ROR1 în biopsiile țesutului mamar au fost, de asemenea, asociate cu tumori mamare agresive de tip bazal (BL) și migrarea acestora către alte părți ale corpului. Mai mult, supraexprimarea ROR1 a fost identificată ca un marker prognostic pentru dezvoltarea TNBC (Chien et al., 2016). Cu toate acestea, reducerea la tăcere a ROR1 folosind CRISPR/Cas9 pentru a suprima creșterea și metastaza TNBC ar fi o strategie eficientă.
Procesul de sialilare implică adăugarea de acid sialic la glicoconjugate, catalizat de sialiltransferaze (ST). ST8SIA1 aparține familiei ST și joacă un rol important în patogeneza diferitelor boli, cum ar fi leucemia limfocitară și cancerul colorectal (Chang et al., 2018). Analiza secvenței ARN arată că ST8SIA1 este exprimat la niveluri ridicate în țesutul mamar al pacienților cu cancer tumoral trigeminal (TNBC) și este corelat pozitiv cu mutații ale genei supresoare tumorale p53, care pot contribui la patogeneza TNBC (Battula et al., 2017). În plus, ST8SIA1 este implicat în metastazele și recurența TNBC, sugerând că joacă un rol important în apariția și dezvoltarea TNBC. Într-un model in vitro de TNBC, s-a demonstrat că inhibiția ST8SIA1 de către CRIPSR/Cas9 blochează creșterea și metastazele (Battula et al., 2017). Acest lucru sugerează că CRISPR/Cas9 ar putea fi un instrument important pentru inhibarea funcției oncogenei ST8SIA1 în tratamentul TNBC.
NAT1 este o enzimă metabolică ce catalizează formarea compușilor xenobiotici de fază II și este exprimată în aproape toate țesuturile umane. NAT1 poate utiliza cofactorul folat pentru a viza acetil-CoA (acetil-CoA) chiar și în absența substratului de amină aromatică (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studiile au arătat că NAT1 reglează funcția metaloproteinazei matriceale 9 (MMP9) în modelele de celule canceroase de sân și protejează împotriva speciilor reactive de oxigen (ROS) în timpul privațiunii de glucoză (Wang et al., 2018). S-a demonstrat că ștergerea NAT1 inhibă complexul piruvat dehidrogenază, ducând la disfuncție mitocondrială (Wang L. et al., 2019). În plus, diverse alte rapoarte au arătat că inhibarea NAT1 folosind molecule mici și reducerea la tăcere a siRNA poate reduce invazivitatea și proliferarea celulelor canceroase de sân (Stepp et al., 2018). Recent, CRISPR/Cas9 a fost utilizat pentru a suprima NAT1 în linia celulară de cancer mamar MDA-MB-231, afectând metabolismul celular în funcție de nivelul său de expresie. Acest studiu a arătat, de asemenea, că NAT-1 este esențial pentru progresia și metastaza cancerului mamar trigeminal (TNBC) (Carlisle et al., 2020).
Transcripția coordonată a oncogenelor este reglată de super-amplificatori, factori de transcripție și cofactori (Hnisz et al., 2015). În plus, un grup de kinaze dependente de ciclină (CDK), cum ar fi CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 și CDK13, sunt necesare pentru reglarea transcripțională. Printre acestea, CDK7 este implicată în fosforilarea ARN polimerazei II, care este foarte importantă pentru inițierea și extinderea transcripției oncogene în patogeneza carcinomului trigeminal (TNBC). Într-un studiu fundamental, ștergerea CDK7 de către CRISPR/Cas9 a inhibat TNBC, indicând faptul că patogeneza TNBC este dependentă de CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Studiile au arătat că mutațiile în MYC și RBP (proteina de legare a ARN) pot duce la apoptoză, în timp ce mutațiile genetice unice în MYC sau RBP nu afectează creșterea celulelor canceroase (Einstein et al., 2021). Peste 1000 de RBP-uri din genomul uman au fost analizate folosind o bibliotecă bazată pe CRISPR/Cas9. Printre acestea, 57 de RBP-uri s-au dovedit a fi critice pentru creșterea celulelor canceroase cu niveluri MYC foarte ridicate (Wheeler et al., 2020). În plus, YTHDF2 este important pentru menținerea creșterii celulelor TNBC și reduce cantitatea de transcrieri metilate în timpul transcripției și translației la nivel înalt în celulele canceroase cu expresie MYC mai mare. În plus, YTHDF2 nu este esențial pentru celulele canceroase, care sunt mai puțin dependente de nivelurile ridicate de MYC pentru a prelungi supraviețuirea pacienților cu TNBC (Einstein et al., 2021), sugerând că ar putea fi o țintă terapeutică potențială pentru medicamentele care pot depăși TNBC.
Proteinele cu deget de zinc (ZNF) reprezintă aproximativ 1% din genomul uman total. Studiile au arătat că ZNF poate regla proliferarea celulară în diverse tipuri de cancer, cum ar fi cancerul hepatic, cancerul de sân și cancerul colorectal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Bibliotecile generate prin eliminarea genei CRISPR au fost utilizate pentru a examina diverse gene supresoare tumorale (TSG) în celulele cancerului de sân (Shalem et al., 2014). De atunci, un studiu transcriptomic al celulelor canceroase de sân cu deleție CRISPR/Cas9 ZNF319 a arătat că ZNF319 este o genă supresoare tumorală care reduce proliferarea cancerului de sân și, prin urmare, este implicată în diverse mecanisme potențiale de semnalizare și alte funcții biologice (Wang L. et al., 2022).
Ferroptoza este un tip de moarte celulară programată care depinde de prezența fierului. Se știe că dezvoltarea ferroptozei este influențată de prezența peroxizilor lipidici. În plus, s-a raportat că PKCβII prezintă peroxidare lipidică precoce, iar peroxidarea lipidică crescută este asociată cu ferroptoza. Screening-ul unei biblioteci de inhibitori ai kinazei mediați de CRISPR/Cas9 a relevat că PKCβII este implicată în procesul de peroxidare lipidică, care este esențial pentru ferroptoză în celulele MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Prin urmare, acest lucru sugerează că eliminarea PKCβII de către CRISPR/Cas9 ar putea fi o potențială țintă a genei supresoare tumorale pentru tratamentul bolilor legate de ferroptoză (Zhang et al., 2022).
Se consideră că rezistența la medicamente este responsabilă pentru aproximativ 90% din decesele pacienților cu cancer și reprezintă una dintre principalele provocări în tratamentul cancerului (Bukowski și colab., 2020). Rezultatele indică faptul că un număr suficient de gene legate de efluxul medicamentelor, repararea ADN-ului, apoptoza și diverse căi de semnalizare celulară sunt asociate cu rezistența la medicamente (Haider și colab., 2020). Printre acestea, mai multe gene au fost vizate de instrumentele CRISPR/Cas9 și au arătat rezultate promițătoare în reducerea rezistenței la medicamente și creșterea eficacității tratamentelor anticancerigene (Vaghari-Tabari și colab., 2022). În plus, bibliotecile de screening cu knockout al genei CRISPR/Cas9 de mare randament au fost implicate în modificarea funcției potențialelor ținte genetice de rezistență la medicamente (Shalem și colab., 2015). Pentru a identifica genele de rezistență la paclitaxel, secvențierea ARN cuplată cu screening-ul bibliotecii de ARN sg la nivelul întregului genom a fost utilizată pentru a identifica opt gene candidate, inclusiv histone deacetilaza 9 (HDAC9), care sunt asociate cu rezistența la medicamente la pacienții cu TNBC recurent (B et al., 2020). Într-un alt studiu, s-a observat o expresie crescută a diserinei/treoninei și tirozin protein kinazei (DSTYK) în timpul supraviețuirii pacienților cu TNBC tratați cu medicamente anticancerigene. Mai mult, inhibiția DSTYK mediată de CRISPR/Cas9 a crescut semnificativ apoptoza celulelor canceroase rezistente la medicamente in vitro (celule SUM102PT și celule MDA-MB-468) și într-un model TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Deși celulele tumorale trigeminale (TNBC) prezintă o activare anormală a căii MAPK, efectul clinic al terapiilor direcționate către MEK este slab. Un screening al bibliotecii genomice CRISPR/Cas9 a relevat că inhibarea PSMG2 (chaperona 2 a asamblării proteomului) sensibilizează celulele TNBC BT549 și MB468 la inhibitorul MEK AZD6244. Inhibarea PSMG2 de către CRISPR/Cas9 a modificat funcția normală a proteasomului, ducând la dezasamblarea PDPK1 mediată de autofagie, îmbunătățind astfel și mai mult celulele tumorale în modelele de șoareci TNBC induse de AZD6244 (inhibitor MEK) și MG132 (inhibitor proteasom). Astfel, inhibitorii proteasomului și ai kinazei MAP (MEK) pot fi administrați sinergic pentru a reduce proliferarea celulelor tumorale (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 a fost utilizat și pentru a depista pierderea funcției genelor care duce la rezistență la TNBC (Shu și colab., 2020). Ge și colab. au explicat mecanismul de rezistență la medicamente al celulelor canceroase tratate cu JQ1, un inhibitor al bromodomenului BET (BBDI), în TNBC. Folosind CRISPR/Cas9, au descoperit că ștergerea genei rb1 a determinat TNBC să devină rezistent la medicamentul anticancerigen JQ1. Prin urmare, funcția rb1 este importantă în răspunsul la medicamentele JQ1 în TNBC. De asemenea, au raportat că paclitaxelul este un inhibitor al kinazei/microtubulilor CDK4/6, iar combinația sa cu BBDI, cum ar fi JQ1, poate oferi răspunsuri terapeutice promițătoare la TNBC rezistent la medicamente (Ge și colab., 2020).
Peisajul transcripțional al ARN-ului lung necodificator (lncARN) a fost raportat ca fiind responsabil pentru rezistența la terapia neoadjuvantă în TNBC. Acest studiu arată că cinci transcrieri diferite de lncARN MALAT1 sunt exprimate la nivel înalt în TNBC. În plus, deleția MALAT1 mediată de CRISPR/Cas9 a crescut sensibilitatea celulelor TNBC BT-549 la paclitaxel și doxorubicină, sugerând un rol potențial al rezistenței la MALAT1 în TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutațiile din BRCA1 (BRCA1m) sunt eterogene și, prin urmare, dificil de detectat. Vizarea PARP1 (poli(ADP-riboză) polimerază), partenerul letal sintetic al BRCA1, poate crește chemosensibilitatea la medicamentele pentru TNBC. Folosind CRISPR/Cas9, deleția PARP1 a crescut sensibilitatea medicamentelor anticancerigene, cum ar fi doxorubicina, gemcitabina și docetaxelul, la celulele TNBC mutante mBRCA1, sugerând că PARP1 este implicată și în rezistența la medicamente în TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutațiile din genele supresoare tumorale BRCA1 sau BRCA2 sunt cunoscute pentru creșterea probabilității de a dezvolta cancer mamar la oameni. Tratamentul acestor pacienți necesită utilizarea inhibitorilor PARP. În plus, s-a demonstrat că eliminarea factorului de salvare a nucleotidelor DNPH1 folosind CRISPR/Cas9 poate elimina nucleotidul toxic 5-hidroximetildeoxiuridină (hmdU) monofosfat, sporind astfel răspunsul celulelor cu deficit de BRCA la sensibilitatea la inhibitorii PARP (Fugger și colab., 2021). Astfel, inhibitorii CRISPR/Cas9 și PARP1 pot deveni o strategie importantă de tratament pentru TNBC.
Gena glicoproteinei penetrante (P-gp) este o genă de rezistență multiplă la medicamente, care este în general suprareglată în aproximativ 41% din toate cancerele de sân trigeminat (TNBC) (Sun et al., 2020). Efluxul de medicamente indus de P-gp a fost identificat ca un regulator cheie al rezistenței la medicamente în cancerul de sân. Inhibitorii P-gp au demonstrat o sensibilitate crescută la medicamentele anticancerigene în cancerul de sân (Famta et al., 2021). Astfel, ablația sau suprimarea P-gp și a inhibitorilor P-gp mediată de CRISPR/Cas9 pot fi metode foarte importante pentru a depăși rezistența la medicamente în TNBC.
Se știe că transportorul casetei de legare a ATP G2 (ABCG2) provoacă rezistență la medicamente în carcinomul trigeminal (TNBC) (Palasuberniam et al., 2015), deși în prezent nu există rapoarte privind relația dintre reducerea la tăcere a CRISPR/Cas9 și ABCG2 și inactivarea genei supresoare tumorale. PTEN poate spori activarea ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Prin urmare, utilizarea CRISP/Ca9 pentru a elimina ABCG2 și combinarea acestuia cu un inhibitor ABCG2 poate fi un tratament adecvat pentru a depăși rezistența la medicamente în TNBC. Tabelul 2 menționează că CRISPR/Cas9 vizează toate genele de rezistență.
Tabelul 2. CRISPR/Cas9 vizează diverse gene de rezistență la TNBC pentru a sensibiliza celulele la medicamentele anticancerigene.
Bibliotecile CRISPR/Cas9 sunt instrumente potențiale pentru screening-ul mutațiilor genetice asociate cu patogeneza cancerului (Chan et al., 2022). Această metodă de screening implică patru etape, cum ar fi (a) construirea bibliotecii, (b) transducția lentivirală, (c) screening-ul fenotipic și (d) analiza genei țintă. Deși TNBC prezintă o activare anormală a căii MAPK, prognosticul clinic al terapiei țintite MEK pentru pacienții cu TNBC care poartă mutații în gene supresoare tumorale, cum ar fi PTEN, RB1 și TP53, este foarte slab.
În plus, un screening de gene knockout utilizând CRISPR/Cas9 a testat cea mai puternică și selectivă moleculă, dehidrocatrolul, care este abundent în extractele de flori și frunze din Guatemala, pentru a înțelege efectul dehidrocatrolului asupra MDA-MB-231. Mecanisme de citotoxicitate celulară selectivă. Caracteristicile tulpinii mezenchimale ale subtipurilor de TNBC. Acest screening bazat pe CRISPR/Cas9 a relevat, de asemenea, că HSD17B11, o genă care codifică 17β-hidroxisteroid dehidrogenaza tip 11, este puternic exprimată în celulele MDA-MB-231 și are ca rezultat dehidrofalcarinol specific pentru celulele MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Astfel, acest lucru sugerează că screening-ul genomic CRISPR/Cas9 are un mare potențial în identificarea mecanismelor care stau la baza proprietăților anticancerigene ale potențialilor compuși naturali.
În plus, vulnerabilitatea carcinomului tumoral trigeminal (CTM) la cancer a fost studiată utilizând un screening CRISPR/Cas9 in vivo, imparțial, la nivelul întregului genom, care a arătat o legătură între căile oncogene și cele supresoare tumorale. S-a raportat că componentele cheie ale căilor mTOR și Hippo joacă roluri importante în reglarea tumorală în CTM. În plus, studiile au arătat că inhibarea farmacologică a oncoproteinei mTORC1/2 și YAP inhibă eficient patogenitatea CTM utilizând un model de sinergie medicament-matrice in vitro și xenogrefe in vivo derivate de la pacient. Mai mult, inhibarea mTORC1/2 mediată de Torin-1 sporește macropinocitoza, în timp ce inhibarea YAP indusă de verteporfină duce la moartea celulelor CTM. Luate împreună, aceste rezultate evidențiază puterea și robustețea screeningului CRISPR in vivo la nivelul întregului genom pentru a identifica tratamente noi și eficiente pentru CTM (Dai și colab., 2021).
Disreglarea sistemului imunitar este un factor important în tumorogeneză. Celulele canceroase evită eliminarea imună prin ocolirea mecanismelor de apărare, inclusiv interferând cu activitatea celulelor imune în micromediul tumoral și compromițând sistemul imunitar. Prin urmare, dezvoltarea unui sistem imunitar îmbunătățit poate fi o abordare cheie în combaterea tumorilor. Utilizarea modificării genetice bazate pe CRISPR/Cas9 abordează mai multe probleme legate de disfuncția imună din perspective diferite. CRISPR/Cas9 a fost utilizat pentru a îmbunătăți imunitatea antitumorală împotriva cancerului de sân prin următoarele căi (Figura 3).
Figura 3. Imunoterapia CRISPR/Cas9 vizează celulele TNBC. Pierderea CDK5 și reducerea activității PDL1 și CD155 amplifică sistemul imunitar. De asemenea, pierderea A2AR și reducerea activității TAA, cum ar fi HER2, mucina 1 și TEM8, au crescut eficiența celulelor CAR-T în uciderea celulelor canceroase. Screening-ul celulelor T bazat pe CRISPR/Cas9 a arătat că perturbarea kinazei p38 sporește activitatea antitumorală a celulelor T. Celulele T modificate de CRISPR/Cas9 cresc expresia TCR (receptorul celulelor T), rezultând în celule T cu activitate antitumorală.
Scopul imunoterapiei este de a stimula sistemul imunitar să atace celulele canceroase. Supraexprimarea proteinelor de control imun previne de obicei reacțiile autoimune, dar poate ajuta cancerele să le evite (Topalian și colab., 2015). Aceste proteine ​​previn reacțiile imune prin legarea la receptorii de pe suprafața celulelor imune. Mai multe proteine ​​de control (cum ar fi CD155 și PD-L1) vizează receptorul PD-1 de pe celulele imune și sunt exprimate în cancerul de sân, în special în cancerul de tip TNBC (Li Y.-C. și colab., 2020). Inhibarea expresiei PD-L1 sau a receptorului său folosind CRISPR/Cas9 poate stimula sistemul imunitar să atace tumorile TNBC (Yahata și colab., 2019). În plus, s-a demonstrat că reglarea negativă a expresiei PD-L1 prin ștergerea CDK5 mediată de CRISPR/Cas9 inhibă creșterea tumorii in vitro și in vivo (Deng și colab., 2020). Inhibarea creșterii în modelele in vitro și in vivo ale cancerului de sân sugerează că reducerea CD155 mediată de shRNA ar putea avea un efect terapeutic asupra cancerului de sân (Gao și colab., 2018).
Celulele T CAR exprimă CAR-uri care recunosc antigenele asociate tumorii (TAA) și pot utiliza inhibarea proteinelor de control pentru a le spori activitatea (Li C. și colab., 2020). Există diverse ținte potențiale pentru terapia cu celule T CAR în cancerul de sân, inclusiv mai multe TAA, cum ar fi HER2, mucin1 și TEM8 (Bajgain și colab., 2018). Există dovezi că celulele T CAR care vizează mezotelina (supraexprimată în celulele TNBC BT-459) sunt mai eficiente împotriva cancerului atunci când PD-1 este eliminat folosind CRISPR/Cas9 (Hu și colab., 2019). Cu toate acestea, izolarea celulelor T de la pacienți și apoi editarea lor ex vivo este un proces care necesită multă muncă și mult timp. Deși celulele T universale pot reduce cerințele de izolare, celulele T donatoare care exprimă antigenul leucocitar uman (HLA clasa I) și receptorul celulelor T (TCR) ar trebui îndepărtate pentru a preveni anomaliile grefă-contra-gazdă (Ren și colab., 2017, 2017a). Folosind CRISPR/Cas9, HDR poate elimina simultan TCR și HLA și poate elimina gena care codifică CAR. Studiile au arătat că CRISPR/Cas9 poate fi utilizat pentru a introduce CAR anti-CD19 în locusul TCR, producând astfel eficient CAR fără a epuiza celulele T (Dimitri și colab., 2022). Au fost dezvoltate tehnologii multiplex pentru a genera celule T CAR alogene prin eliminarea simultană a TCR, beta-2-microglobulinei (B2M), subunității HLA-I și a altor proteine, cum ar fi PD-1 și CTLA-4, care pot avea proprietăți anticancerigene mai mari împotriva TNBC (Eyquem și colab., 2017; Liu și colab., 2017; Ren și colab., 2017b; Dimitri și colab., 2022).
Utilizarea CRISPR/Cas9 ar putea îmbunătăți eficacitatea celulelor CAR-T. Se știe că adenozina are proprietăți imunosupresoare și poate reduce imunitatea anticancerigenă prin blocarea funcției celulelor T și activarea receptorilor de adenozină A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Reducerea la tăcere a A2AR folosind CRISPR/Cas9 a îmbunătățit semnificativ eficacitatea celulelor CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). Se știe că celulele T prezintă diverse caracteristici fenotipice, cum ar fi expansiunea celulară, diferențierea, stresul oxidativ și stresul genomic. Screening-ul celulelor T bazat pe CRISPR/Cas9 a relevat perturbarea a 25 de kinaze diferite ale receptorilor celulelor T. Printre acestea, s-a demonstrat că ștergerea kinazei p38 sporește activitatea antitumorală a celulelor T, indicând faptul că kinaza p38 este un regulator cheie al reglării celulelor CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
Celulele T pot fi modificate genetic folosind CRISPR/Cas9 pentru a produce TCR-uri cu exprimare ridicată. Transferul celulelor T modificate genetic către pacienți a demonstrat o activitate anticancerigenă mai puternică decât celulele T endogene. Prin urmare, TCR-urile endogene pot concura cu TCR-urile modificate genetic la pacienți, ceea ce poate afecta potențialul imunoterapiei împotriva cancerului. Pentru a depăși această problemă, utilizarea CRISPR/Cas9 pentru a elimina TCR-β endogen în celulele receptoare și ulterior transferul celulelor T TCR-β către pacienții cu cancer poate prezenta răspunsuri imune anticancerigene mai bune, fără a fi nevoie de competiție sexuală endogenă între TCR-uri (Fan et al. 2018). Astfel, cu excepția celulelor T modificate cu CRISPR, TCR-urile sunt de o mie de ori mai sensibile la antigenele tumorale decât celulele T normale transduse cu TCR. În plus, în diferite leucemii, celulele T modificate generate de γδ TCR+ CRISPR prezintă o expresie mai mare a celulelor T CD4+ și CD8+ decât transferul standard de TCR (Legut et al., 2018). Astfel, celulele T modificate generate de CRISPR/Cas9 pot fi o metodă eficientă de imunoterapie pentru a depăși TNBC.
Integrinele sunt molecule de adeziune celulară prezente în transmembranele celulare și promovează legarea celulelor la matricea extracelulară (MEC) (Hamidi și Ivaska, 2018). Disreglarea integrinelor este asociată cu dezvoltarea și migrarea cancerului prin modificarea matricei extracelulare, ducând la supraviețuirea celulelor canceroase în circulație (Hamidi și Ivaska, 2018). Inhibarea integrinei mediată de CRISPR/Cas9 încetinește progresia tumorii, metastaza și colonizarea în carcinomul trigeminal (TNBC). S-a raportat că inhibiția integrinei a5 (ITGA5) reduce migrarea și progresia celulelor în alte tipuri de cancer, cum ar fi cancerul pulmonar (Ju și colab., 2017), sugerând că integrina a5 poate fi, de asemenea, un factor cheie în patogeneza TNBC.
Generarea de șoareci knockout folosind metode tradiționale de generare a celulelor stem embrionare (ES) este un proces care necesită multă muncă, mult timp și este ineficient. Durează luni și chiar ani pentru a viza celulele ES prin recombinare omoloagă, a reproduce șoareci himerici și apoi a-i încrucișa cu șoareci heterozigoți pentru a produce urmași homozigoți. Încrucișarea complexă este necesară pentru a crea șoareci cu mutații genetice multiple. Cu toate acestea, au apărut multe probleme atunci când s-au utilizat șoareci generați prin ablația celulelor ES folosind CRISPR/Cas9 sau prin microinjectarea componentelor CRISPR/Cas9 în ouă fertilizate unicelulare. De exemplu, introducerea modificărilor are loc adesea la locusurile bialelice și nu este specifică genei. Recent, s-a raportat că celulele ES care utilizează tehnologia CRISPR/Cas9 pot insera simultan mutații bialelice în până la 5 gene (Nishizono et al., 2021). În acest scop, ARNm Cas9 și cinci ARN-uri specifice genei au fost transfectate simultan în celule ES. Acest lucru evidențiază promisiunea și eficacitatea acestei proceduri, deși este posibil ca aceste mutații să fi fost transmise mai departe atunci când liniile fondatoare au fost create pentru a produce șoareci cvintupli knockout. Studiul raportează, de asemenea, o descoperire surprinzătoare: celulele ES nu mai sunt necesare pentru a crea șoareci modificați genetic. În schimb, pentru a elimina anumite produse genetice, ARNm Cas9 și ARNg au fost injectate în embrioni în stadiu unicelular. Drept urmare, au fost create linii fondatoare knockout care pot fi utilizate teoretic pentru a studia consecințele ștergerii genelor la șoareci (Qin et al., 2016). Astfel, CRISPR/Cas9 permite crearea de șoareci transgenici pentru a trata carcinomul trigeminal (TNBC) la un cost mai mic decât ingineria genetică tradițională. Folosind sistemul CRISPR/Cas, a fost dezvoltat un nou model de șoarece knockout care poate introduce cu succes mutații punctuale într-una sau mai multe gene endogene în TNBC. Pe baza acestui concept, modelele animale de TNBC pot fi dezvoltate și folosind deleția BRCA1 și p53 mediată de CRISPR/Cas9, rezultând pierderea reparării HR, instabilitate genomică și fenotipuri mutante (Annunziato et al., 2020).
În prezent, diverse metode, cum ar fi mamografia, imagistica prin rezonanță magnetică (IRM) și ecografia, sunt utilizate pentru a diagnostica cancerul mamar trigeminal (CMTN). Cu toate acestea, aceste metode au unele limitări. Mamografia este utilizată pentru a diagnostica țesutul mamar local, mai degrabă decât metastazele, unde celulele canceroase au migrat către alte organe. Ecografia nu este o metodă fiabilă pentru diagnosticarea CMTN (Chen și Lee-Felker, 2023). IRM-ul are o sensibilitate mai mare decât ecografia și mamografia, dar precizia sa diagnostică este limitată (Sha și Chen, 2022). Biopsia tisulară este o modalitate invazivă de a identifica celulele canceroase. Cu toate acestea, în unele cazuri, o biopsie poate rata țesutul canceros dacă acul se îndepărtează de zona de interes. În plus, este foarte scumpă și poate fi traumatizantă pentru pacientă. CMTN este un tip eterogen de cancer, astfel încât o biopsie poate să nu ofere suficiente informații despre tipul de cancer. Prin urmare, este nevoie urgentă de o nouă metodă fiabilă din punct de vedere diagnostic pentru detectarea CMTN. CRISPR/Cas9 poate servi ca o alternativă extrem de sensibilă și minim invazivă pentru diagnosticarea cancerului mamar. În acest scop, strategiile bazate pe CRISPR/Cas9 pot fi utilizate pentru a îmbunătăți metodele PCR de diagnosticare a cancerului trigeminal (TNBC). Mai întâi, proteinele Cas9 și cpf1 ale sistemului CRISPR sunt utilizate pentru a elimina ADN-ul nespecific, iar apoi aceste două proteine ​​(Cas9 și cpf1) pot recunoaște secvența PAM înainte de a se lega de ADN-ul țintă (Deepak Singh și colab., 2021). Astfel, PCR poate identifica mutațiile asociate cu dezvoltarea cancerului. Mai multe studii au adoptat această strategie bazată pe CRISPR pentru a detecta diferite mutații în diferite tipuri de cancer (Safari și colab., 2019). Astfel, metodele PCR bazate pe CRISPR pot reduce dependența diagnosticării TNBC de metodele invazive, cum ar fi imunohistochimia bazată pe biopsie.
Modificări genotipice în reglarea receptorilor hormonali au fost demonstrate și în cazul carcinomului trifazic de tip TNBC (Chen și Russo, 2009). Strategiile PCR bazate pe CRISPR/Cas9, care utilizează microarray-uri pentru diagnosticare la fața locului, pot monitoriza eficient aceste mutații (Hajian și colab., 2019). De asemenea, ar putea oferi furnizorilor de servicii medicale informații relevante despre mutații specifice la pacienții cu carcinom trifazic de tip TNBC, ceea ce ar putea ajuta la îmbunătățirea cursului tratamentului lor. Cu toate acestea, această tehnică combinată are limitări. Prin urmare, sunt necesare eforturi extinse de cercetare înainte ca această metodă CRISPR/Cas-PCR să poată fi utilizată în asistența medicală pentru diagnosticarea carcinomului trifazic de tip TNBC (Yang și colab., 2019).