Diagnosticul diferențial al nodulilor pulmonari identificați prin tomografie computerizată (CT) rămâne o provocare în practica clinică. Aici, caracterizăm metabolomul global a 480 de probe de ser, inclusiv subiecți sănătoși din grupul de control, noduli pulmonari benigni și adenocarcinom pulmonar în stadiul I. Adenocarcinoamele prezintă profiluri metabolomice unice, în timp ce nodulii benigni și persoanele sănătoase au o similaritate ridicată în profilurile metabolomice. În grupul de descoperire (n = 306), a fost identificat un set de 27 de metaboliți pentru a diferenția între nodulii benigni și cei malign. ASC a modelului discriminant în grupurile de validare internă (n = 104) și validare externă (n = 111) a fost de 0,915 și, respectiv, 0,945. Analiza căii metabolice a relevat o creștere a metaboliților glicolitici asociați cu o scădere a triptofanului în serul de adenocarcinom pulmonar în comparație cu nodulii benigni și subiecții sănătoși din grupul de control și a sugerat că absorbția de triptofan promovează glicoliza în celulele cancerului pulmonar. Studiul nostru evidențiază valoarea biomarkerilor metaboliților serici în evaluarea riscului de noduli pulmonari detectați prin tomografie computerizată.
Diagnosticul precoce este esențial pentru îmbunătățirea ratelor de supraviețuire la pacienții cu cancer. Rezultatele Studiului Național de Screening pentru Cancerul Pulmonar din SUA (NLST) și ale Studiului European NELSON au arătat că screening-ul cu tomografie computerizată cu doze mici (LDCT) poate reduce semnificativ mortalitatea prin cancer pulmonar la grupurile cu risc crescut1,2,3. De la utilizarea pe scară largă a LDCT pentru screening-ul cancerului pulmonar, incidența constatărilor radiografice incidentale ale nodulilor pulmonari asimptomatici a continuat să crească4. Nodulii pulmonari sunt definiți ca opacități focale de până la 3 cm în diametru5. Ne confruntăm cu dificultăți în evaluarea probabilității de malignitate și în gestionarea numărului mare de noduli pulmonari detectați incidental la LDCT. Limitările CT pot duce la examinări frecvente de urmărire și rezultate fals pozitive, ceea ce duce la intervenții inutile și supratratament6. Prin urmare, este nevoie de dezvoltarea de biomarkeri fiabili și utili pentru a identifica corect cancerul pulmonar în stadiile incipiente și a diferenția majoritatea nodulilor benigni la detectarea inițială7.
Analiza moleculară cuprinzătoare a sângelui (ser, plasmă, celule mononucleare din sângele periferic), inclusiv genomica, proteomica sau metilarea ADN-ului8,9,10, a condus la un interes crescând pentru descoperirea biomarkerilor de diagnostic pentru cancerul pulmonar. Între timp, abordările metabolomice măsoară produsele finale celulare care sunt influențate de acțiuni endogene și exogene și, prin urmare, sunt aplicate pentru a prezice debutul și evoluția bolii. Cromatografia lichidă-spectrometria de masă în tandem (LC-MS) este o metodă utilizată pe scară largă pentru studiile metabolomice datorită sensibilității sale ridicate și gamei dinamice largi, care poate acoperi metaboliți cu proprietăți fizico-chimice diferite11,12,13. Deși analiza metabolomică globală a plasmei/serului a fost utilizată pentru a identifica biomarkerii asociați cu diagnosticul cancerului pulmonar14,15,16,17 și eficacitatea tratamentului,18 clasificatorii metaboliților serici pentru a distinge între nodulii pulmonari benigni și malign rămân de studiat mult. -cercetare masivă.
Adenocarcinomul și carcinomul cu celule scuamoase sunt cele două subtipuri principale de cancer pulmonar fără celule mici (NSCLC). Diverse teste de screening CT indică faptul că adenocarcinomul este cel mai frecvent tip histologic de cancer pulmonar1,19,20,21. În acest studiu, am utilizat cromatografia lichidă ultraperformantă-spectrometrie de masă de înaltă rezoluție (UPLC-HRMS) pentru a efectua analize metabolomice pe un total de 695 de probe de ser, inclusiv controale sănătoase, noduli pulmonari benigni și noduli ≤3 cm detectați prin CT. Screening pentru adenocarcinomul pulmonar în stadiul I. Am identificat un grup de metaboliți serici care disting adenocarcinomul pulmonar de nodulii benigni și controalele sănătoase. Analiza de îmbogățire a căii de transmitere a relevat că metabolismul anormal al triptofanului și glucozei sunt modificări frecvente în adenocarcinomul pulmonar în comparație cu nodulii benigni și controalele sănătoase. În cele din urmă, am stabilit și validat un clasificator metabolic seric cu specificitate și sensibilitate ridicată pentru a distinge între nodulii pulmonari malign și cei benigni detectați prin LDCT, ceea ce poate ajuta la diagnosticul diferențial precoce și la evaluarea riscului.
În studiul actual, probe serice de aceeași vârstă și sex au fost colectate retrospectiv de la 174 de subiecți sănătoși din grupul de control, 292 de pacienți cu noduli pulmonari benigni și 229 de pacienți cu adenocarcinom pulmonar în stadiul I. Caracteristicile demografice ale celor 695 de subiecți sunt prezentate în Tabelul suplimentar 1.
După cum se arată în Figura 1a, un total de 480 de probe de ser, inclusiv 174 de control sănătos (HC), 170 de noduli benigni (BN) și 136 de probe de adenocarcinom pulmonar (LA) în stadiul I, au fost colectate la Centrul de Cancer al Universității Sun Yat-sen. Cohorta de descoperire pentru profilarea metabolomică nețintită utilizând cromatografia lichidă ultra-performanță-spectrometrie de masă de înaltă rezoluție (UPLC-HRMS). După cum se arată în Figura suplimentară 1, au fost identificați metaboliți diferențiali între LA și HC, LA și BN pentru a stabili un model de clasificare și a explora în continuare analiza căilor diferențiale. 104 probe colectate de Centrul de Cancer al Universității Sun Yat-sen și 111 probe colectate de alte două spitale au fost supuse validării interne, respectiv externe.
a Populația de studiu din cohorta de descoperire care a fost supusă unei analize metabolomice serice globale utilizând cromatografie lichidă ultraperformantă - spectrometrie de masă de înaltă rezoluție (UPLC-HRMS). b Analiza discriminantă parțială a celor mai mici pătrate (PLS-DA) a metabolomului total a 480 de probe de ser din cohorta de studiu, inclusiv controale sănătoase (HC, n = 174), noduli benigni (BN, n = 170) și adenocarcinom pulmonar în stadiul I (Los Angeles, n = 136). +ESI, mod de ionizare prin electrospray pozitiv, -ESI, mod de ionizare prin electrospray negativ. c–e Metaboliții cu abundențe semnificativ diferite în două grupuri date (test Wilcoxon bilateral cu semn, valoare p ajustată la rata de descoperire falsă, FDR <0,05) sunt arătați cu roșu (modificare > 1,2) și albastru (modificare < 0,83). ) arătați pe graficul vulcanului. f Hartă termică de grupare ierarhică care arată diferențe semnificative în numărul de metaboliți adnotați între LA și BN. Datele sursă sunt furnizate sub formă de fișiere cu date sursă.
Metabolomul seric total al 174 HC, 170 BN și 136 LA din grupul de descoperire a fost analizat utilizând analiza UPLC-HRMS. Mai întâi demonstrăm că probele de control al calității (QC) se grupează strâns în centrul unui model de analiză a componentelor principale (PCA) nesupravegheat, confirmând stabilitatea performanței studiului actual (Figura suplimentară 2).
Așa cum se arată în analiza discriminantă parțială prin cele mai mici pătrate (PLS-DA) din Figura 1b, am constatat că au existat diferențe clare între LA și BN, LA și HC în modurile de ionizare prin electrospray pozitivă (+ESI) și negativă (-ESI). Cu toate acestea, nu s-au găsit diferențe semnificative între BN și HC în condiții +ESI și -ESI.
Am găsit 382 de caracteristici diferențiale între LA și HC, 231 de caracteristici diferențiale între LA și BN și 95 de caracteristici diferențiale între BN și HC (testul Wilcoxon pentru ranguri cu semn, FDR <0,05 și modificări multiple >1,2 sau <0,83) (Figura .1c-e). Vârfurile au fost adnotate suplimentar (Date suplimentare 3) în raport cu o bază de date (biblioteca mzCloud/HMDB/Chemspider) prin valoarea m/z, timpul de retenție și căutarea spectrului de masă prin fragmentare (detalii descrise în secțiunea Metode) 22. În cele din urmă, au fost identificați 33 și 38 de metaboliți adnotați cu diferențe semnificative în abundență pentru LA versus BN (Figura 1f și Tabelul suplimentar 2) și respectiv LA versus HC (Figura suplimentară 3 și Tabelul suplimentar 2). În schimb, doar 3 metaboliți cu diferențe semnificative în abundență au fost identificați în BN și HC (Tabelul suplimentar 2), în concordanță cu suprapunerea dintre BN și HC în PLS-DA. Acești metaboliți diferențiali acoperă o gamă largă de substanțe biochimice (Figura suplimentară 4). Luate împreună, aceste rezultate demonstrează modificări semnificative ale metabolomului seric care reflectă transformarea malignă a cancerului pulmonar în stadiu incipient, comparativ cu nodulii pulmonari benigni sau subiecții sănătoși. Între timp, similaritatea metabolomului seric al BN și HC sugerează că nodulii pulmonari benigni pot avea multe caracteristici biologice comune cu indivizii sănătoși. Având în vedere că mutațiile genei receptorului factorului de creștere epidermală (EGFR) sunt frecvente în adenocarcinomul pulmonar subtipul 23, am căutat să determinăm impactul mutațiilor driver asupra metabolomului seric. Apoi, am analizat profilul metabolomic general a 72 de cazuri cu status EGFR în grupul cu adenocarcinom pulmonar. Interesant este că am găsit profiluri comparabile între pacienții cu mutație EGFR (n = 41) și pacienții cu tip sălbatic EGFR (n = 31) în analiza PCA (Figura suplimentară 5a). Cu toate acestea, am identificat 7 metaboliți a căror abundență a fost semnificativ modificată la pacienții cu mutație EGFR comparativ cu pacienții cu EGFR de tip sălbatic (test t, p < 0,05 și modificare de ori > 1,2 sau < 0,83) (Figura suplimentară 5b). Majoritatea acestor metaboliți (5 din 7) sunt acilcarnitine, care joacă un rol important în căile de oxidare a acizilor grași.
Așa cum este ilustrat în fluxul de lucru prezentat în Figura 2a, biomarkerii pentru clasificarea nodulilor au fost obținuți utilizând operatori de contracție absolută minimă și selecție bazată pe 33 de metaboliți diferențiali identificați în LA (n = 136) și BN (n = 170). Cea mai bună combinație de variabile (LASSO) – model de regresie logistică binară. Validarea încrucișată de zece ori a fost utilizată pentru a testa fiabilitatea modelului. Selecția variabilelor și regularizarea parametrilor sunt ajustate printr-o penalizare de maximizare a probabilității cu parametrul λ24. Analiza metabolomică globală a fost efectuată în continuare independent în grupurile de validare internă (n = 104) și validare externă (n = 111) pentru a testa performanța de clasificare a modelului discriminant. Ca rezultat, 27 de metaboliți din setul de descoperire au fost identificați ca fiind cel mai bun model discriminant cu cea mai mare valoare medie a ASC (Fig. 2b), dintre care 9 au avut activitate crescută și 18 activitate scăzută în LA comparativ cu BN (Fig. 2c).
Flux de lucru pentru construirea unui clasificator de noduli pulmonari, inclusiv selectarea celui mai bun panel de metaboliți serici din setul de descoperire utilizând un model de regresie logistică binară prin validare încrucișată de zece ori și evaluarea performanței predictive în seturi de validare interne și externe. b Statistici de validare încrucișată ale modelului de regresie LASSO pentru selecția biomarkerilor metabolici. Numerele de mai sus reprezintă numărul mediu de biomarkeri selectați la un anumit λ. Linia punctată roșie reprezintă valoarea medie a ASC la lambda corespunzătoare. Barele de eroare gri reprezintă valorile ASC minime și maxime. Linia punctată indică cel mai bun model cu cei 27 de biomarkeri selectați. ASC, aria de sub curba caracteristicii de operare a receptorului (ROC). c Modificări ale oriilor de operare a 27 de metaboliți selectați în grupul LA comparativ cu grupul BN din grupul de descoperire. Coloana roșie – activare. Coloana albastră reprezintă un declin. d–f Curbele caracteristicii de operare a receptorului (ROC) care arată puterea modelului discriminant bazat pe 27 de combinații de metaboliți în seturile de descoperire, validare internă și externă. Datele sursă sunt furnizate sub formă de fișiere de date sursă.
Un model de predicție a fost creat pe baza coeficienților de regresie ponderați ai acestor 27 de metaboliți (Tabelul suplimentar 3). Analiza ROC bazată pe acești 27 de metaboliți a generat o valoare a ariei de sub curbă (ASC) de 0,933, sensibilitatea grupului de descoperire a fost de 0,868, iar specificitatea a fost de 0,859 (Fig. 2d). Între timp, printre cei 38 de metaboliți diferențiali adnotați între LA și HC, un set de 16 metaboliți a atins o ASC de 0,902 cu o sensibilitate de 0,801 și o specificitate de 0,856 în discriminarea LA de HC (Figura suplimentară 6a-c). Valorile ASC bazate pe diferite praguri de modificare a oriilor pentru metaboliții diferențiali au fost, de asemenea, comparate. Am constatat că modelul de clasificare a avut cele mai bune performanțe în discriminarea între LA și BN (HC) atunci când nivelul de modificare a oriilor a fost setat la 1,2 față de 1,5 sau 2,0 (Figura suplimentară 7a,b). Modelul de clasificare, bazat pe 27 de grupuri de metaboliți, a fost validat în continuare în cohorte interne și externe. ASC a fost de 0,915 (sensibilitate 0,867, specificitate 0,811) pentru validarea internă și de 0,945 (sensibilitate 0,810, specificitate 0,979) pentru validarea externă (Fig. 2e, f). Pentru a evalua eficiența interlaboratoare, 40 de probe din cohorta externă au fost analizate într-un laborator extern, așa cum este descris în secțiunea Metode. Precizia clasificării a atins o ASC de 0,925 (Figura suplimentară 8). Deoarece carcinomul pulmonar cu celule scuamoase (LUSC) este al doilea cel mai frecvent subtip de cancer pulmonar fără celule mici (NSCLC) după adenocarcinomul pulmonar (LUAD), am testat și utilitatea potențială validată a profilurilor metabolice. BN și 16 cazuri de LUSC. ASC de discriminare între LUSC și BN a fost de 0,776 (Figura suplimentară 9), indicând o capacitate mai slabă în comparație cu discriminarea între LUAD și BN.
Studiile au arătat că dimensiunea nodulilor pe imaginile CT este corelată pozitiv cu probabilitatea de malignitate și rămâne un factor determinant major al tratamentului nodulilor25,26,27. Analiza datelor din cohorta mare a studiului de screening NELSON a arătat că riscul de malignitate la subiecții cu ganglioni <5 mm a fost chiar similar cu cel al subiecților fără ganglioni28. Prin urmare, dimensiunea minimă care necesită monitorizare CT regulată este de 5 mm, așa cum este recomandat de Societatea Britanică de Torace (BTS), și de 6 mm, așa cum este recomandat de Societatea Fleischner29. Cu toate acestea, nodulii mai mari de 6 mm și fără caracteristici benigne evidente, numiți noduli pulmonari indeterminați (NPI), rămân o provocare majoră în evaluare și gestionare în practica clinică30,31. În continuare, am examinat dacă dimensiunea nodulilor a influențat semnăturile metabolomice utilizând probe grupate din cohortele de descoperire și validare internă. Concentrându-ne pe 27 de biomarkeri validați, am comparat mai întâi profilurile PCA ale metabolomilor HC și BN sub-6 mm. Am constatat că majoritatea punctelor de date pentru HC și BN s-au suprapus, demonstrând că nivelurile serice ale metaboliților au fost similare în ambele grupuri (Fig. 3a). Hărțile caracteristicilor în diferite intervale de dimensiuni au rămas conservate în BN și LA (Fig. 3b, c), în timp ce s-a observat o separare între nodulii malign și cei benigni în intervalul 6-20 mm (Fig. 3d). Această cohortă a avut o ASC de 0,927, o specificitate de 0,868 și o sensibilitate de 0,820 pentru prezicerea malignității nodulilor cu dimensiuni cuprinse între 6 și 20 mm (Fig. 3e, f). Rezultatele noastre arată că clasificatorul poate surprinde modificările metabolice cauzate de transformarea malignă timpurie, indiferent de dimensiunea nodulului.
ad Compararea profilurilor PCA între grupuri specificate pe baza unui clasificator metabolic de 27 de metaboliți. CC și BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. în LA 6–20 mm versus LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm și LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Curba caracteristicii de operare a receptorului (ROC) care arată performanța modelului discriminant pentru noduli de 6–20 mm. f Valorile de probabilitate au fost calculate pe baza modelului de regresie logistică pentru noduli cu dimensiunile de 6–20 mm. Linia punctată gri reprezintă valoarea limită optimă (0,455). Numerele de mai sus reprezintă procentul de cazuri proiectate pentru Los Angeles. Se utilizează un test t Student bilateral. PCA, analiza componentelor principale. ASC a ariei de sub curbă. Datele sursă sunt furnizate sub formă de fișiere cu date sursă.
Patru probe (cu vârste cuprinse între 44 și 61 de ani) cu dimensiuni similare ale nodulilor pulmonari (7-9 mm) au fost selectate suplimentar pentru a ilustra performanța modelului propus de predicție a malignității (Fig. 4a, b). La screening-ul inițial, Cazul 1 s-a prezentat ca un nodul solid cu calcificare, o caracteristică asociată cu benignitatea, în timp ce Cazul 2 s-a prezentat ca un nodul parțial solid indeterminat, fără caracteristici benigne evidente. Trei runde de scanări CT ulterioare au arătat că aceste cazuri au rămas stabile pe o perioadă de 4 ani și, prin urmare, au fost considerate noduli benigni (Fig. 4a). Comparativ cu evaluarea clinică a scanărilor CT seriale, analiza metaboliților serici cu o singură doză, cu modelul actual de clasificare, a identificat rapid și corect acești noduli benigni pe baza constrângerilor probabilistice (Tabelul 1). Figura 4b din cazul 3 prezintă un nodul cu semne de retracție pleurală, care este cel mai adesea asociată cu malignitatea32. Cazul 4 s-a prezentat ca un nodul parțial solid indeterminat, fără dovezi ale unei cauze benigne. Toate aceste cazuri au fost prezise ca fiind maligne conform modelului clasificatorului (Tabelul 1). Evaluarea adenocarcinomului pulmonar a fost demonstrată prin examen histopatologic după intervenția chirurgicală de rezecție pulmonară (Fig. 4b). Pentru setul de validare externă, clasificatorul metabolic a prezis cu exactitate două cazuri de noduli pulmonari nedeterminați mai mari de 6 mm (Figura suplimentară 10).
Imagini CT ale ferestrei axiale a plămânilor a două cazuri de noduli benigni. În cazul 1, scanarea CT după 4 ani a arătat un nodul solid stabil, cu dimensiunea de 7 mm, cu calcificare în lobul inferior drept. În cazul 2, scanarea CT după 5 ani a relevat un nodul stabil, parțial solid, cu un diametru de 7 mm în lobul superior drept. b Imagini CT în fereastră axială a plămânilor și studii patologice corespunzătoare a două cazuri de adenocarcinom în stadiul I înainte de rezecția pulmonară. Cazul 3 a relevat un nodul cu un diametru de 8 mm în lobul superior drept, cu retracție pleurală. Cazul 4 a relevat un nodul parțial solid, cu aspect de sticlă mată, cu dimensiunea de 9 mm în lobul superior stâng. Colorația cu hematoxilină și eozină (H&E) a țesutului pulmonar rezecat (bare de scală = 50 μm) demonstrează modelul de creștere acinară al adenocarcinomului pulmonar. Săgețile indică nodulii detectați pe imaginile CT. Imaginile H&E sunt imagini reprezentative ale unor câmpuri microscopice multiple (>3) examinate de către patolog.
Luate împreună, rezultatele noastre demonstrează valoarea potențială a biomarkerilor metaboliților serici în diagnosticul diferențial al nodulilor pulmonari, ceea ce poate reprezenta dificultăți în evaluarea screeningului CT.
Pe baza unui panel validat de metaboliți diferențiali, am căutat să identificăm corelații biologice ale modificărilor metabolice majore. Analiza de îmbogățire a căii metabolice KEGG realizată de MetaboAnalyst a identificat 6 căi metabolice comune semnificativ alterate între cele două grupuri date (LA vs. HC și LA vs. BN, p ajustat ≤ 0,001, efect > 0,01). Aceste modificări au fost caracterizate prin perturbări ale metabolismului piruvatului, metabolismului triptofanului, metabolismului niacinei și nicotinamidei, glicolizei, ciclului TCA și metabolismului purinelor (Fig. 5a). Apoi, am efectuat metabolomică țintită pentru a verifica modificările majore folosind cuantificarea absolută. Determinarea metaboliților comuni în căile metabolice frecvent alterate prin spectrometrie de masă triplă cuadrupolă (QQQ) utilizând standarde autentice de metaboliți. Caracteristicile demografice ale eșantionului țintă din studiul metabolomic sunt incluse în Tabelul suplimentar 4. În concordanță cu rezultatele noastre globale de metabolomică, analiza cantitativă a confirmat că hipoxantina și xantina, piruvatul și lactatul au fost crescute în LA comparativ cu BN și HC (Fig. 5b, c, p <0,05). Cu toate acestea, nu s-au constatat diferențe semnificative în acești metaboliți între BN și HC.
Analiza de îmbogățire a căii KEGG a metaboliților semnificativ diferiți în grupul LA comparativ cu grupurile BN și HC. S-a utilizat un Globaltest bilateral, iar valorile p au fost ajustate folosind metoda Holm-Bonferroni (p ajustat ≤ 0,001 și dimensiunea efectului > 0,01). b–d Diagrame Violin care prezintă nivelurile de hipoxantină, xantină, lactat, piruvat și triptofan în HC, BN și LA serice determinate prin LC-MS/MS (n = 70 per grup). Liniile punctate albe și negre indică mediana și, respectiv, quartila. e Diagramă Violin care prezintă expresia ARNm normalizată Log2TPM (transcrieri per milion) a SLC7A5 și QPRT în adenocarcinomul pulmonar (n = 513) comparativ cu țesutul pulmonar normal (n = 59) în setul de date LUAD-TCGA. Caseta albă reprezintă intervalul intercuartil, linia neagră orizontală din centru reprezintă mediana, iar linia neagră verticală care se extinde din casetă reprezintă intervalul de încredere (IC) de 95%. f Diagrama de corelație Pearson pentru expresia SLC7A5 și GAPDH în adenocarcinomul pulmonar (n = 513) și țesutul pulmonar normal (n = 59) în setul de date TCGA. Zona gri reprezintă IÎ de 95%. r, coeficientul de corelație Pearson. g Nivelurile celulare normalizate de triptofan în celulele A549 transfectate cu control shRNA nespecific (NC) și shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinate prin LC-MS/MS. Este prezentată analiza statistică a cinci probe biologic independente din fiecare grup. h Nivelurile celulare de NADt (NAD total, inclusiv NAD+ și NADH) în celulele A549 (NC) și celulele A549 cu SLC7A5 knockdown (Sh1, Sh2). Este prezentată analiza statistică a trei probe biologic independente din fiecare grup. Activitatea glicolitică a celulelor A549 înainte și după inhibarea genei SLC7A5 a fost măsurată prin rata de acidificare extracelulară (ECAR) (n = 4 probe biologic independente per grup). 2-DG,2-deoxi-D-glucoză. Testul t Student bilateral a fost utilizat în (b-h). În (g-i), barele de eroare reprezintă media ± deviația standard, fiecare experiment a fost efectuat de trei ori independent, iar rezultatele au fost similare. Datele sursă sunt furnizate sub formă de fișiere cu date sursă.
Având în vedere impactul semnificativ al metabolismului modificat al triptofanului în grupul LA, am evaluat și nivelurile serice de triptofan în grupurile HC, BN și LA utilizând QQQ. Am constatat că triptofanul seric a fost redus în LA comparativ cu HC sau BN (p < 0,001, Figura 5d), ceea ce este în concordanță cu descoperirile anterioare conform cărora nivelurile circulante de triptofan sunt mai scăzute la pacienții cu cancer pulmonar decât la subiecții sănătoși din grupul de control33,34,35. Un alt studiu care a utilizat trasorul PET/CT 11C-metil-L-triptofan a constatat că timpul de retenție a semnalului de triptofan în țesutul canceros pulmonar a fost semnificativ crescut în comparație cu leziunile benigne sau țesutul normal36. Ipoteza noastră este că scăderea triptofanului în serul LA poate reflecta absorbția activă a triptofanului de către celulele canceroase pulmonare.
De asemenea, se știe că produsul final al căii kinureninei din catabolismul triptofanului este NAD+37,38, care este un substrat important pentru reacția gliceraldehidei-3-fosfatului cu 1,3-bisfosfogliceratul în glicoliză39. În timp ce studiile anterioare s-au concentrat pe rolul catabolismului triptofanului în reglarea imună, noi am căutat să elucidam interacțiunea dintre disreglarea triptofanului și căile glicolitice observate în studiul actual. Se știe că membrul 5 al familiei transportorilor de soluți 7 (SLC7A5) este un transportor de triptofan43,44,45. Fosforiboziltransferaza acidului chinolinic (QPRT) este o enzimă situată în aval de calea kinureninei care transformă acidul chinolinic în NAMN46. Inspecția setului de date LUAD TCGA a relevat că atât SLC7A5, cât și QPRT au fost semnificativ suprareglate în țesutul tumoral în comparație cu țesutul normal (Fig. 5e). Această creștere a fost observată în stadiile I și II, precum și în stadiile III și IV ale adenocarcinomului pulmonar (Figura suplimentară 11), indicând perturbări precoce ale metabolismului triptofanului asociate cu tumorogeneza.
În plus, setul de date LUAD-TCGA a arătat o corelație pozitivă între expresia ARNm a SLC7A5 și GAPDH în probele pacienților cu cancer (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f). În schimb, nu s-a găsit nicio corelație semnificativă între astfel de semnături genetice în țesutul pulmonar normal (r = 0,25, p = 0,06, Figura 5f). Inhibarea expresiei SLC7A5 (Figura suplimentară 12) în celulele A549 a redus semnificativ nivelurile celulare de triptofan și NAD(H) (Figura 5g, h), rezultând o activitate glicolitică atenuată, măsurată prin rata de acidificare extracelulară (ECAR) (Figura 1). 5i). Astfel, pe baza modificărilor metabolice din ser și a detectării in vitro, emitem ipoteza că metabolismul triptofanului poate produce NAD+ prin calea kinureninei și poate juca un rol important în promovarea glicolizei în cancerul pulmonar.
Studiile au arătat că un număr mare de noduli pulmonari nedeterminați detectați prin tomografie computerizată cu densitate redusă (LDCT) poate duce la necesitatea unor teste suplimentare, cum ar fi PET-CT, biopsia pulmonară și supratratamentul din cauza unui diagnostic fals pozitiv de malignitate.31 După cum se arată în Figura 6, studiul nostru a identificat un grup de metaboliți serici cu valoare diagnostică potențială, care poate îmbunătăți stratificarea riscului și gestionarea ulterioară a nodulilor pulmonari detectați prin tomografie computerizată.
Nodulii pulmonari sunt evaluați utilizând tomografie computerizată cu doze mici (LDCT) cu caracteristici imagistice sugestive pentru cauze benigne sau maligne. Rezultatul incert al nodulilor poate duce la vizite frecvente de urmărire, intervenții inutile și supratratament. Includerea clasificatorilor metabolici serici cu valoare diagnostică poate îmbunătăți evaluarea riscului și gestionarea ulterioară a nodulilor pulmonari. Tomografie cu emisie de pozitroni PET.
Datele din studiul NLST din SUA și din studiul european NELSON sugerează că screening-ul grupurilor cu risc ridicat prin tomografie computerizată cu doze mici (LDCT) poate reduce mortalitatea prin cancer pulmonar1,3. Cu toate acestea, evaluarea riscurilor și gestionarea clinică ulterioară a unui număr mare de noduli pulmonari incidentali detectați prin LDCT rămân cele mai dificile. Scopul principal este de a optimiza clasificarea corectă a protocoalelor existente bazate pe LDCT prin încorporarea unor biomarkeri fiabili.
Anumiți biomarkeri moleculari, cum ar fi metaboliții din sânge, au fost identificați prin compararea cancerului pulmonar cu cei ai grupului de control sănătos15,17. În studiul actual, ne-am concentrat pe aplicarea analizei metabolomice serice pentru a distinge între nodulii pulmonari benigni și malign detectați întâmplător prin LDCT. Am comparat metabolomul seric global al probelor de control sănătos (HC), al nodulilor pulmonari benigni (BN) și al adenocarcinomului pulmonar (AL) în stadiul I utilizând analiza UPLC-HRMS. Am constatat că HC și BN au avut profiluri metabolice similare, în timp ce AL a prezentat modificări semnificative în comparație cu HC și BN. Am identificat două seturi de metaboliți serici care diferențiază AL de HC și BN.
Schema actuală de identificare a nodulilor benigni și maligni bazată pe tomografie computerizată de jos a pielii (LDCT) se bazează în principal pe dimensiunea, densitatea, morfologia și rata de creștere a nodulilor în timp30. Studiile anterioare au arătat că dimensiunea nodulilor este strâns legată de probabilitatea apariției cancerului pulmonar. Chiar și la pacienții cu risc crescut, riscul de malignitate la ganglionii <6 mm este <1%. Riscul de malignitate pentru nodulii cu dimensiuni cuprinse între 6 și 20 mm variază de la 8% la 64%30. Prin urmare, Societatea Fleischner recomandă un diametru limită de 6 mm pentru urmărirea de rutină prin CT.29 Cu toate acestea, evaluarea riscului și gestionarea nodulilor pulmonari nedeterminați (NPI) mai mari de 6 mm nu au fost efectuate în mod adecvat31. Gestionarea actuală a cardiopatiilor congenitale se bazează de obicei pe așteptarea vigilentă cu monitorizare CT frecventă.
Pe baza metabolomului validat, am demonstrat pentru prima dată suprapunerea semnăturilor metabolomice între indivizii sănătoși și nodulii benigni <6 mm. Similitudinea biologică este în concordanță cu descoperirile anterioare ale tomografiei computerizate (CT), conform cărora riscul de malignitate pentru nodulii <6 mm este la fel de scăzut ca pentru subiecții fără noduli.30 Trebuie menționat că rezultatele noastre demonstrează, de asemenea, că nodulii benigni <6 mm și ≥6 mm au o similaritate ridicată în profilurile metabolomice, sugerând că definiția funcțională a etiologiei benigne este consistentă, indiferent de dimensiunea nodulului. Astfel, panelurile moderne de metaboliți serici de diagnostic pot oferi un singur test ca test de excludere atunci când nodulii sunt detectați inițial la CT și pot reduce potențial monitorizarea serială. În același timp, același panel de biomarkeri metabolici a distins nodulii malign cu dimensiunea ≥6 mm de nodulii benigni și a oferit predicții precise pentru nodulii neoplasmatici invazivi (PNI) de dimensiuni similare și caracteristici morfologice ambigue pe imaginile CT. Acest clasificator al metabolismului seric a avut performanțe bune în prezicerea malignității nodulilor ≥6 mm cu o ASC de 0,927. Luate împreună, rezultatele noastre indică faptul că semnăturile metabolomice serice unice pot reflecta în mod specific modificările metabolice induse de tumoră timpurii și pot avea o valoare potențială ca predictori de risc, independent de dimensiunea nodulilor.
În special, adenocarcinomul pulmonar (LUAD) și carcinomul cu celule scuamoase (LUSC) sunt principalele tipuri de cancer pulmonar fără celule mici (NSCLC). Având în vedere că LUAD este puternic asociat cu consumul de tutun47, iar LUAD este cea mai frecventă histologie a nodulilor pulmonari incidentali detectați la screening-ul CT48, modelul nostru de clasificare a fost construit special pentru probele de adenocarcinom în stadiul I. Wang și colegii săi s-au concentrat, de asemenea, pe LUAD și au identificat nouă semnături lipidice folosind lipidomica pentru a distinge cancerul pulmonar în stadiu incipient de persoanele sănătoase17. Am testat modelul actual de clasificare pe 16 cazuri de LUSC în stadiul I și 74 de noduli benigni și am observat o precizie scăzută de predicție a LUSC (ASC 0,776), sugerând că LUAD și LUSC ar putea avea propriile semnături metabolomice. Într-adevăr, s-a demonstrat că LUAD și LUSC diferă în ceea ce privește etiologia, originea biologică și aberațiile genetice49. Prin urmare, alte tipuri de histologie ar trebui incluse în modelele de antrenament pentru detectarea cancerului pulmonar bazată pe populație în programele de screening.
Aici, am identificat cele șase căi metabolice cel mai frecvent alterate în adenocarcinomul pulmonar, comparativ cu controalele sănătoase și nodulii benigni. Xantina și hipoxantina sunt metaboliți comuni ai căii metabolice a purinelor. În concordanță cu rezultatele noastre, intermediarii asociați cu metabolismul purinelor au fost semnificativ crescuți în serul sau țesuturile pacienților cu adenocarcinom pulmonar, comparativ cu controalele sănătoase sau pacienții aflați în stadiul preinvaziv15,50. Nivelurile serice crescute de xantină și hipoxantină pot reflecta anabolismul necesar celulelor canceroase cu proliferare rapidă. Disreglarea metabolismului glucozei este o caracteristică binecunoscută a metabolismului cancerului51. Aici, am observat o creștere semnificativă a piruvatului și lactatului în grupul LA, comparativ cu grupul HC și BN, ceea ce este în concordanță cu rapoartele anterioare privind anomaliile căii glicolitice în profilurile metabolomului seric al pacienților cu cancer pulmonar fără celule mici (NSCLC) și al controalelor sănătoase. Rezultatele sunt consistente52,53.
Este important de menționat că am observat o corelație inversă între metabolismul piruvatului și triptofanului în serul adenocarcinoamelor pulmonare. Nivelurile serice de triptofan au fost reduse în grupul LA comparativ cu grupul HC sau BN. Interesant este că un studiu anterior la scară largă, utilizând o cohortă prospectivă, a constatat că nivelurile scăzute de triptofan circulant au fost asociate cu un risc crescut de cancer pulmonar 54. Triptofanul este un aminoacid esențial pe care îl obținem în întregime din alimente. Concluzionăm că epuizarea triptofanului seric în adenocarcinomul pulmonar poate reflecta epuizarea rapidă a acestui metabolit. Este bine cunoscut faptul că produsul final al catabolismului triptofanului prin calea kinureninei este sursa sintezei de novo NAD+. Deoarece NAD+ este produs în principal prin calea de salvare, importanța NAD+ în metabolismul triptofanului în sănătate și boală rămâne de determinat46. Analiza noastră a bazei de date TCGA a arătat că expresia transportorului de substanțe dizolvate al transportorului de triptofan 7A5 (SLC7A5) a fost semnificativ crescută în adenocarcinomul pulmonar comparativ cu grupul de control normal și a fost corelată pozitiv cu expresia enzimei glicolitice GAPDH. Studiile anterioare s-au concentrat în principal pe rolul catabolismului triptofanului în suprimarea răspunsului imun antitumoral40,41,42. Aici demonstrăm că inhibarea absorbției de triptofan prin reducerea expresiei SLC7A5 în celulele canceroase pulmonare are ca rezultat o scădere ulterioară a nivelurilor celulare de NAD și o atenuare concomitentă a activității glicolitice. În concluzie, studiul nostru oferă o bază biologică pentru modificările metabolismului seric asociate cu transformarea malignă a adenocarcinomului pulmonar.
Mutațiile EGFR sunt cele mai frecvente mutații driver la pacienții cu NSCLC. În studiul nostru, am constatat că pacienții cu mutație EGFR (n = 41) au avut profiluri metabolomice generale similare cu pacienții cu EGFR de tip sălbatic (n = 31), deși am găsit niveluri serice scăzute la unii pacienți cu mutație EGFR la pacienții cu acilcarnitină. Funcția stabilită a acilcarnitinelor este de a transporta grupările acil din citoplasmă în matricea mitocondrială, ducând la oxidarea acizilor grași pentru a produce energie 55. În concordanță cu descoperirile noastre, un studiu recent a identificat, de asemenea, profiluri metabolomice similare între tumorile cu EGFR mutant și EGFR de tip sălbatic, analizând metabolomul global a 102 probe de țesut de adenocarcinom pulmonar 50. Interesant este că, în grupul cu mutație EGFR s-a constatat și conținutul de acilcarnitină. Prin urmare, este posibil ca studiul suplimentar să fie necesar pentru a stabili dacă modificările nivelurilor de acilcarnitină reflectă modificările metabolice induse de EGFR și căile moleculare subiacente.
În concluzie, studiul nostru stabilește un clasificator metabolic seric pentru diagnosticul diferențial al nodulilor pulmonari și propune un flux de lucru care poate optimiza evaluarea riscurilor și facilita managementul clinic bazat pe screening-ul prin tomografie computerizată.
Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică al Spitalului de Oncologie al Universității Sun Yat-sen, Primul Spital Afiliat al Universității Sun Yat-sen și Comitetul de Etică al Spitalului de Oncologie al Universității Zhengzhou. În grupurile de descoperire și validare internă, au fost colectate 174 de seruri de la persoane sănătoase și 244 de seruri de la noduli benigni de la persoane supuse examenelor medicale anuale la Departamentul de Control și Prevenire a Cancerului, Centrul de Oncologie al Universității Sun Yat-sen, și 166 de seruri de la noduli benigni. Adenocarcinoamele pulmonare în stadiul I au fost colectate de la Centrul de Oncologie al Universității Sun Yat-sen. În cohorta de validare externă, au existat 48 de cazuri de noduli benigni, 39 de cazuri de adenocarcinom pulmonar în stadiul I de la Primul Spital Afiliat al Universității Sun Yat-sen și 24 de cazuri de adenocarcinom pulmonar în stadiul I de la Spitalul de Oncologie Zhengzhou. Centrul de Oncologie al Universității Sun Yat-sen a colectat, de asemenea, 16 cazuri de cancer pulmonar scuamos în stadiul I pentru a testa capacitatea de diagnostic a clasificatorului metabolic stabilit (caracteristicile pacienților sunt prezentate în Tabelul suplimentar 5). Probele din cohorta de descoperire și cohorta de validare internă au fost colectate între ianuarie 2018 și mai 2020. Probele pentru cohorta de validare externă au fost colectate între august 2021 și octombrie 2022. Pentru a minimiza prejudecățile de gen, fiecărei cohorte i-au fost atribuite un număr aproximativ egal de cazuri de sex masculin și feminin. Echipa de descoperire și Echipa internă de revizuire. Sexul participanților a fost determinat pe baza auto-raportării. Consimțământul informat a fost obținut de la toți participanții și nu a fost oferită nicio compensație. Subiecții cu noduli benigni au fost cei cu un scor stabil la scanarea CT la 2 până la 5 ani la momentul analizei, cu excepția unui caz din eșantionul de validare externă, care a fost colectat preoperator și diagnosticat prin histopatologie. Cu excepția bronșitei cronice. Cazurile de adenocarcinom pulmonar au fost colectate înainte de rezecția pulmonară și confirmate prin diagnostic patologic. Probele de sânge à jeun au fost colectate în tuburi de separare a serului, fără anticoagulante. Probele de sânge au fost coagulate timp de 1 oră la temperatura camerei și apoi centrifugate la 2851 × g timp de 10 minute la 4°C pentru a colecta supernatantul serului. Alicotele de ser au fost congelate la -80°C până la extracția metabolitului. Departamentul de Prevenire a Cancerului și Examinare Medicală al Centrului de Oncologie al Universității Sun Yat-sen a colectat un lot de ser de la 100 de donatori sănătoși, inclusiv un număr egal de bărbați și femei cu vârste cuprinse între 40 și 55 de ani. Volume egale din fiecare probă de donator au fost amestecate, lot-ul rezultat a fost împărțit în alicote și depozitat la -80°C. Amestecul de ser a fost utilizat ca material de referință pentru controlul calității și standardizarea datelor.
Serul de referință și probele de testare au fost decongelate, iar metaboliții au fost extrași folosind o metodă combinată de extracție (MTBE/metanol/apă) 56. Pe scurt, 50 μl de ser au fost amestecați cu 225 μl de metanol răcit ca gheața și 750 μl de metil tert-butil eter (MTBE) răcit ca gheața. Se agită amestecul și se incubează pe gheață timp de 1 oră. Probele au fost apoi amestecate și vortexate cu 188 μl de apă de calitate MS conținând standarde interne (13C-lactat, 13C3-piruvat, 13C-metionină și 13C6-izoleucină, achiziționate de la Cambridge Isotope Laboratories). Amestecul a fost apoi centrifugat la 15.000 × g timp de 10 minute la 4 °C, iar faza inferioară a fost transferată în două tuburi (câte 125 μL fiecare) pentru analiza LC-MS în mod pozitiv și negativ. În final, proba a fost evaporată până la uscare într-un concentrator în vid de mare viteză.
Metaboliții uscați au fost reconstituiți în 120 μl de acetonitril 80%, vortexați timp de 5 minute și centrifugați la 15.000 × g timp de 10 minute la 4°C. Supernatanții au fost transferați în flacoane de sticlă de culoarea chihlimbarului cu microinserții pentru studii metabolomice. Analiză metabolomică nețintită pe o platformă de cromatografie lichidă de ultraperformanță-spectrometrie de masă de înaltă rezoluție (UPLC-HRMS). Metaboliții au fost separați utilizând un sistem Dionex Ultimate 3000 UPLC și o coloană ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). În modul de ioni pozitivi, fazele mobile au fost 95% (A) și 50% acetonitril (B), fiecare conținând 10 mmol/L acetat de amoniu și 0,1% acid formic. În modul negativ, fazele mobile A și B conțineau 95%, respectiv 50% acetonitril, ambele faze conținând 10 mmol/L acetat de amoniu, pH = 9. Programul de gradient a fost următorul: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. Coloana a fost menținută la 40°C, iar proba la 10°C în autosampler. Debitul a fost de 0,3 ml/min, iar volumul injectat a fost de 3 μl. Un spectrometru de masă Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) cu o sursă de ionizare prin electrospray (ESI) a fost operat în modul de scanare completă și cuplat cu modul de monitorizare ddMS2 pentru a colecta volume mari de date. Parametrii MS au fost setați după cum urmează: tensiune de pulverizare +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatură capilară 320°C, gaz de protecție 40 arb, gaz auxiliar 10 arb, temperatură încălzitor sondă 350°C, interval de scanare 70–1050 m/h, rezoluție 70 000. Datele au fost achiziționate folosind Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Pentru a evalua calitatea datelor, au fost generate probe grupate de control al calității (QC) prin prelevarea a 10 μL de supernatant din fiecare probă. Șase injecții cu probe de control al calității au fost analizate la începutul secvenței analitice pentru a evalua stabilitatea sistemului UPLC-MS. Probele de control al calității sunt apoi introduse periodic în lot. Toate cele 11 loturi de probe de ser din acest studiu au fost analizate prin LC-MS. Alicote dintr-un amestec de ser de la 100 de donatori sănătoși au fost utilizate ca material de referință în loturile respective pentru a monitoriza procesul de extracție și a ajusta efectele de la lot la lot. Analiza metabolomică nețintită a cohortei de descoperire, a cohortei de validare internă și a cohortei de validare externă a fost efectuată la Centrul de Metabolomică al Universității Sun Yat-sen. Laboratorul extern al Centrului de Analiză și Testare al Universității de Tehnologie din Guangdong a analizat, de asemenea, 40 de probe din cohorta externă pentru a testa performanța modelului de clasificare.
După extracție și reconstituire, cuantificarea absolută a metaboliților serici a fost măsurată utilizând cromatografie lichidă de ultra-înaltă performanță - spectrometrie de masă tandem (Agilent 6495 triplu cuadrupol) cu o sursă de ionizare prin electrospray (ESI) în modul de monitorizare a reacțiilor multiple (MRM). O coloană ACQUITY BEH Amidă (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) a fost utilizată pentru separarea metaboliților. Faza mobilă a constat din 90% (A) și 5% acetonitril (B) cu 10 mmol/L acetat de amoniu și soluție de amoniac 0,1%. Programul de gradient a fost următorul: 0–1,5 min, 0% B; 1,5–6,5 min, 0–15% B; 6,5–8 min, 15% B; 8–8,5 min, 15%–0% B; 8,5–11,5 min, 0% B. Coloana a fost menținută la 40 °C, iar proba la 10 °C în autosampler. Debitul a fost de 0,3 mL/min, iar volumul injectat a fost de 1 μL. Parametrii MS au fost setați după cum urmează: tensiune capilară ±3,5 kV, presiunea nebulizatorului 35 psi, debitul gazului de înveliș 12 L/min, temperatura gazului de înveliș 350 °C, temperatura gazului de uscare 250 °C și debitul gazului de uscare 14 l/min. Conversiile MRM ale triptofanului, piruvatului, lactatului, hipoxantinei și xantinei au fost 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 și respectiv 151,0–107,9. Datele au fost colectate utilizând Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Pentru probele de ser, triptofanul, piruvatul, lactatul, hipoxantina și xantina au fost cuantificate folosind curbe de calibrare ale soluțiilor standard de amestec. Pentru probele celulare, conținutul de triptofan a fost normalizat la standardul intern și la masa proteinelor celulare.
Extracția vârfurilor (m/z și timpul de retenție (RT)) a fost efectuată utilizând Compound Discovery 3.1 și TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Pentru a elimina potențialele diferențe dintre loturi, fiecare vârf caracteristic al probei de testare a fost împărțit la vârful caracteristic al materialului de referință din același lot pentru a obține abundența relativă. Abaterile standard relative ale standardelor interne înainte și după standardizare sunt prezentate în Tabelul suplimentar 6. Diferențele dintre cele două grupuri au fost caracterizate prin rata de descoperire falsă (FDR <0,05, testul Wilcoxon cu semn) și schimbarea de ori (>1,2 sau <0,83). Datele MS brute ale caracteristicilor extrase și datele MS corectate cu serul de referință sunt prezentate în Datele suplimentare 1 și, respectiv, Datele suplimentare 2. Adnotarea vârfurilor a fost efectuată pe baza a patru niveluri definite de identificare, inclusiv metaboliți identificați, compuși adnotați presupus, clase de compuși caracterizați presupus și compuși necunoscuți 22. Pe baza căutărilor în baza de date din Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), compușii biologici cu standarde validate de potrivire MS/MS sau adnotări de potrivire exactă în mzCloud (scor > 85) sau Chemspider au fost în final selectați ca intermediari între metabolomul diferențial. Adnotările de vârf pentru fiecare caracteristică sunt incluse în Datele suplimentare 3. MetaboAnalyst 5.0 a fost utilizat pentru analiza univariată a abundenței metaboliților normalizați prin sumă. MetaboAnalyst 5.0 a evaluat, de asemenea, analiza de îmbogățire a căii KEGG pe baza unor metaboliți semnificativ diferiți. Analiza componentelor principale (PCA) și analiza discriminantă parțială a celor mai mici pătrate (PLS-DA) au fost analizate utilizând pachetul software ropls (v.1.26.4) cu normalizare a stivei și scalare automată. Modelul optim de biomarker al metabolitului pentru prezicerea malignității nodulilor a fost generat utilizând regresia logistică binară cu contracție absolută minimă și operatorul de selecție (LASSO, pachetul R v.4.1-3). Performanța modelului discriminant în seturile de detecție și validare a fost caracterizată prin estimarea ASC pe baza analizei ROC conform pachetului pROC (v.1.18.0.). Limita de probabilitate optimă a fost obținută pe baza indicelui Youden maxim al modelului (sensibilitate + specificitate – 1). Probele cu valori mai mici sau mai mari decât pragul vor fi prezise ca noduli benigni, respectiv adenocarcinom pulmonar.
Celulele A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) au fost cultivate în mediu F-12K conținând 10% FBS. Secvențele de ARN scurt în formă de ac de păr (shRNA) care vizează SLC7A5 și un control nedirecționat (NC) au fost inserate în vectorul lentiviral pLKO.1-puro. Secvențele antisens ale shSLC7A5 sunt următoarele: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Anticorpii împotriva SLC7A5 (#5347) și tubulină (#2148) au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology. Anticorpii împotriva SLC7A5 și tubulină au fost utilizați la o diluție de 1:1000 pentru analiza Western blot.
Testul de stres glicolitic Seahorse XF măsoară nivelurile de acidificare extracelulară (ECAR). În cadrul testului, glucoza, oligomicina A și 2-DG au fost administrate secvențial pentru a testa capacitatea glicolitică celulară măsurată prin ECAR.
Celulele A549 transfectate cu control nețintit (NC) și shSLC7A5 (Sh1, Sh2) au fost placate peste noapte în vase cu diametrul de 10 cm. Metaboliții celulari au fost extrași cu 1 ml de metanol apos 80% răcit cu gheață. Celulele din soluția de metanol au fost răzuite, colectate într-un tub nou și centrifugate la 15.000 × g timp de 15 minute la 4°C. Se colectează 800 µl de supernatant și se usucă folosind un concentrator în vid de mare viteză. Peletele de metaboliți uscați au fost apoi analizate pentru nivelurile de triptofan folosind LC-MS/MS, așa cum s-a descris mai sus. Nivelurile celulare de NAD(H) din celulele A549 (NC și shSLC7A5) au fost măsurate folosind un kit colorimetric cantitativ NAD+/NADH (#K337, BioVision), conform instrucțiunilor producătorului. Nivelurile de proteine au fost măsurate pentru fiecare probă pentru a normaliza cantitatea de metaboliți.
Nu s-au utilizat metode statistice pentru a determina preliminar dimensiunea eșantionului. Studiile metabolomice anterioare care au vizat descoperirea de biomarkeri15,18 au fost considerate repere pentru determinarea dimensiunii și, în comparație cu aceste rapoarte, eșantionul nostru a fost adecvat. Nicio probă nu a fost exclusă din cohorta de studiu. Probele serice au fost repartizate aleatoriu într-un grup de descoperire (306 cazuri, 74,6%) și un grup de validare internă (104 cazuri, 25,4%) pentru studii metabolomice nețintite. De asemenea, am selectat aleatoriu 70 de cazuri din fiecare grup din setul de descoperire pentru studii metabolomice țintite. Cercetătorii nu au știut să atribuie grupurile în timpul colectării și analizei datelor LC-MS. Analizele statistice ale datelor metabolomice și ale experimentelor celulare sunt descrise în secțiunile respective Rezultate, Legende ale figurilor și Metode. Cuantificarea triptofanului celular, NADT și a activității glicolitice a fost efectuată de trei ori independent, cu rezultate identice.
Pentru mai multe informații despre designul studiului, consultați rezumatul Raportului Portofoliului Natural asociat acestui articol.
Datele MS brute ale caracteristicilor extrase și datele MS normalizate ale serului de referință sunt prezentate în Datele suplimentare 1 și, respectiv, Datele suplimentare 2. Adnotările de vârf pentru caracteristicile diferențiale sunt prezentate în Datele suplimentare 3. Setul de date LUAD TCGA poate fi descărcat de la https://portal.gdc.cancer.gov/. Datele de intrare pentru reprezentarea graficului sunt furnizate în datele sursă. Datele sursă sunt furnizate pentru acest articol.
Grupul Național de Studiu privind Screeningul Pulmonar etc. Reducerea mortalității prin cancer pulmonar prin tomografie computerizată cu doze mici. Anglia de Nord. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR și Prophet, PC Screening pentru cancerul pulmonar utilizând tomografie computerizată helicoidală cu doze mici: rezultate din Studiul Național de Screening Pulmonar (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ și colab. Reducerea mortalității prin cancer pulmonar prin screening CT volumetric într-un studiu randomizat. Anglia de Nord. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Data publicării: 18 septembrie 2023