Diagnosticul diferențial al nodulilor pulmonari identificați prin tomografie computerizată (CT) rămâne o provocare în practica clinică.Aici, caracterizăm metabolomul global a 480 de probe de ser, inclusiv martori sănătoși, noduli pulmonari benini și adenocarcinom pulmonar în stadiul I.Adenocarcinoamele prezintă profiluri metabolomice unice, în timp ce nodulii benini și indivizii sănătoși au o asemănare mare în profilurile metabolomice.În grupul de descoperire (n = 306), a fost identificat un set de 27 de metaboliți pentru a diferenția între nodulii benini și maligni.AUC-ul modelului discriminant în grupurile de validare internă (n = 104) și validare externă (n = 111) a fost de 0,915 și, respectiv, 0,945.Analiza căii a evidențiat creșterea metaboliților glicolitici asociați cu scăderea triptofanului în serul adenocarcinomului pulmonar în comparație cu nodulii benini și martorii sănătoși și a sugerat că absorbția triptofanului promovează glicoliza în celulele canceroase pulmonare.Studiul nostru evidențiază valoarea biomarkerilor metaboliților serici în evaluarea riscului de noduli pulmonari detectați prin CT.
Diagnosticul precoce este esențial pentru a îmbunătăți ratele de supraviețuire a pacienților cu cancer.Rezultatele studiului național de screening al cancerului pulmonar din SUA (NLST) și ale studiului european NELSON au arătat că screening-ul cu tomografie computerizată cu doze mici (LDCT) poate reduce semnificativ mortalitatea prin cancer pulmonar în grupurile cu risc ridicat1,2,3.De la utilizarea pe scară largă a LDCT pentru screening-ul cancerului pulmonar, incidența constatărilor radiografice incidentale ale nodulilor pulmonari asimptomatici a continuat să crească 4 .Nodulii pulmonari sunt definiți ca opacități focale de până la 3 cm în diametru 5 .Ne confruntăm cu dificultăți în a evalua probabilitatea de malignitate și a face față numărului mare de noduli pulmonari detectați incidental pe LDCT.Limitările CT pot duce la controale frecvente și la rezultate fals pozitive, ducând la intervenții inutile și la supratratament6.Prin urmare, este nevoie de a dezvolta biomarkeri fiabili și utili pentru a identifica corect cancerul pulmonar în stadiile incipiente și pentru a diferenția majoritatea nodulilor benign la detectarea inițială 7 .
Analiza moleculară cuprinzătoare a sângelui (ser, plasmă, celule mononucleare din sângele periferic), inclusiv genomica, proteomica sau metilarea ADN-ului8,9,10, a condus la un interes din ce în ce mai mare pentru descoperirea biomarkerilor de diagnostic pentru cancerul pulmonar.Între timp, abordările metabolomice măsoară produsele finale celulare care sunt influențate de acțiuni endogene și exogene și, prin urmare, sunt aplicate pentru a prezice debutul și rezultatul bolii.Cromatografia lichidă-spectrometria de masă în tandem (LC-MS) este o metodă utilizată pe scară largă pentru studiile metabolomice datorită sensibilității sale ridicate și intervalului dinamic mare, care poate acoperi metaboliți cu proprietăți fizico-chimice diferite11,12,13.Deși analiza metabolomică globală a plasmei/serului a fost utilizată pentru a identifica biomarkeri asociați cu diagnosticul cancerului pulmonar14,15,16,17 și cu eficacitatea tratamentului,18 clasificatorii metaboliților serici pentru a distinge între nodulii pulmonari benini și maligni rămân mult studiati.- cercetare masivă.
Adenocarcinomul și carcinomul cu celule scuamoase sunt cele două subtipuri principale de cancer pulmonar cu celule non-mici (NSCLC).Diverse teste de screening CT indică faptul că adenocarcinomul este cel mai frecvent tip histologic de cancer pulmonar1,19,20,21.În acest studiu, am folosit cromatografie lichidă ultra-performanță-spectrometrie de masă de înaltă rezoluție (UPLC-HRMS) pentru a efectua analize metabolomice pe un total de 695 de probe de ser, inclusiv controale sănătoase, noduli pulmonari benign și detectați prin CT ≤3 cm.Screening pentru adenocarcinom pulmonar stadiul I.Am identificat un grup de metaboliți serici care disting adenocarcinomul pulmonar de nodulii benini și de martori sănătoși.Analiza de îmbogățire a căilor a arătat că metabolismul anormal al triptofanului și al glucozei sunt modificări frecvente ale adenocarcinomului pulmonar în comparație cu nodulii benini și martorii sănătoși.În cele din urmă, am stabilit și validat un clasificator metabolic seric cu specificitate și sensibilitate ridicate pentru a distinge între nodulii pulmonari maligni și benini detectați prin LDCT, care poate ajuta la diagnosticul diferențial precoce și la evaluarea riscului.
În studiul actual, probe de ser potrivite pentru sex și vârstă au fost colectate retrospectiv de la 174 de martori sănătoși, 292 de pacienți cu noduli pulmonari benign și 229 de pacienți cu adenocarcinom pulmonar în stadiul I.Caracteristicile demografice ale celor 695 de subiecți sunt prezentate în Tabelul suplimentar 1.
După cum se arată în Figura 1a, un total de 480 de probe de ser, inclusiv 174 de probe de control sănătos (HC), 170 de noduli benini (BN) și 136 de probe de adenocarcinom pulmonar (LA) în stadiul I, au fost colectate la Centrul de Cancer al Universității Sun Yat-sen.Cohortă de descoperire pentru profilarea metabolomică nețintă folosind cromatografie lichidă ultra-performanță-spectrometrie de masă de înaltă rezoluție (UPLC-HRMS).După cum se arată în figura suplimentară 1, metaboliții diferențiali dintre LA și HC, LA și BN au fost identificați pentru a stabili un model de clasificare și a explora în continuare analiza căii diferențiale.104 probe colectate de Centrul de Cancer al Universității Sun Yat-sen și 111 probe colectate de alte două spitale au fost supuse validării interne și, respectiv, externă.
o Populație de studiu din cohorta de descoperire care a fost supusă analizei metabolomice globale a serului utilizând cromatografie lichidă ultra-performanță-spectrometrie de masă de înaltă rezoluție (UPLC-HRMS).b Analiza discriminantă parțială a celor mai mici pătrate (PLS-DA) a metabolomului total din 480 de probe de ser din cohorta de studiu, inclusiv martori sănătoși (HC, n = 174), noduli benign (BN, n = 170) și adenocarcinom pulmonar în stadiul I (Los Angeles, n = 136).+ESI, modul de ionizare electrospray pozitiv, -ESI, modul de ionizare electrospray negativ.c–e Metaboliții cu abundențe semnificativ diferite în două grupuri date (testul de rang Wilcoxon cu două cozi, valoarea p ajustată pentru rata de descoperire falsă, FDR <0,05) sunt afișate în roșu (modificare ori > 1,2) și albastru (modificare ori <0,83) .) afișat pe graficul vulcanului.f Harta termică de grupare ierarhică care arată diferențe semnificative în numărul de metaboliți adnotați între LA și BN.Datele sursă sunt furnizate sub formă de fișiere de date sursă.
Metabolomul seric total de 174 HC, 170 BN și 136 LA din grupul de descoperire a fost analizat utilizând analiza UPLC-HRMS.Mai întâi arătăm că probele de control al calității (QC) se grupează strâns în centrul unui model de analiză a componentelor principale (PCA) nesupravegheat, confirmând stabilitatea performanței studiului curent (Figura 2 suplimentară).
După cum se arată în analiza parțială cu cele mai mici pătrate-discriminante (PLS-DA) din Figura 1 b, am constatat că au existat diferențe clare între LA și BN, LA și HC în modurile de ionizare electrospray pozitiv (+ESI) și negativ (-ESI). .izolat.Cu toate acestea, nu au fost găsite diferențe semnificative între BN și HC în condiții +ESI și -ESI.
Am găsit 382 de trăsături diferențiale între LA și HC, 231 trăsături diferențiale între LA și BN și 95 de trăsături diferențiale între BN și HC (testul de rang semnat Wilcoxon, FDR <0,05 și schimbare multiplă > 1,2 sau <0,83) (Figura .1c-e) )..Vârfurile au fost adnotate în continuare (Date suplimentare 3) față de o bază de date (bibliotecă mzCloud/HMDB/Chemspider) după valoarea m/z, timpul de retenție și căutarea spectrului de masă de fragmentare (detalii descrise în secțiunea Metode) 22 .În cele din urmă, 33 și 38 de metaboliți adnotați cu diferențe semnificative de abundență au fost identificați pentru LA versus BN (Figura 1f și Tabelul suplimentar 2) și, respectiv, LA versus HC (Figura suplimentară 3 și Tabelul suplimentar 2).În contrast, doar 3 metaboliți cu diferențe semnificative de abundență au fost identificați în BN și HC (Tabelul suplimentar 2), în concordanță cu suprapunerea dintre BN și HC în PLS-DA.Acești metaboliți diferențiali acoperă o gamă largă de substanțe biochimice (Figura suplimentară 4).Luate împreună, aceste rezultate demonstrează schimbări semnificative în metabolomul seric care reflectă transformarea malignă a cancerului pulmonar în stadiu incipient, comparativ cu nodulii pulmonari benign sau subiecții sănătoși.Între timp, asemănarea metabolomului seric al BN și HC sugerează că nodulii pulmonari benini pot împărtăși multe caracteristici biologice cu indivizii sănătoși.Având în vedere că mutațiile genei receptorului factorului de creștere epidermic (EGFR) sunt frecvente în adenocarcinomul pulmonar subtipul 23, am căutat să determinăm impactul mutațiilor driverului asupra metabolomului seric.Apoi am analizat profilul metabolomic global a 72 de cazuri cu statut EGFR în grupul de adenocarcinom pulmonar.Interesant, am găsit profiluri comparabile între pacienții mutanți EGFR (n = 41) și pacienții de tip sălbatic EGFR (n = 31) în analiza PCA (Figura suplimentară 5a).Cu toate acestea, am identificat 7 metaboliți a căror abundență a fost modificată semnificativ la pacienții cu mutație EGFR în comparație cu pacienții cu EGFR de tip sălbatic (test t, p <0,05 și modificarea ori> 1,2 sau <0,83) (Figura suplimentară 5b).Majoritatea acestor metaboliți (5 din 7) sunt acilcarnitine, care joacă un rol important în căile de oxidare a acizilor grași.
După cum este ilustrat în fluxul de lucru prezentat în Figura 2 a, biomarkerii pentru clasificarea nodulilor au fost obținuți utilizând operatori de contracție minimă absolută și selecția pe baza a 33 de metaboliți diferențiați identificați în LA (n = 136) și BN (n = 170).Cea mai bună combinație de variabile (LASSO) – model de regresie logistică binară.Validarea încrucișată de zece ori a fost utilizată pentru a testa fiabilitatea modelului.Selecția variabilelor și regularizarea parametrilor sunt ajustate printr-o penalizare de maximizare a probabilității cu parametrul λ24.Analiza metabolomică globală a fost efectuată în continuare independent în grupurile de validare internă (n = 104) și validare externă (n = 111) pentru a testa performanța de clasificare a modelului discriminant.Ca rezultat, 27 de metaboliți din setul de descoperire au fost identificați ca cel mai bun model discriminant cu cea mai mare valoare medie AUC (Fig. 2b), dintre care 9 au avut activitate crescută și 18 activitate scăzută în LA comparativ cu BN (Fig. 2c).
Flux de lucru pentru construirea unui clasificator de noduli pulmonari, inclusiv selectarea celui mai bun panou de metaboliți serici din setul de descoperire folosind un model de regresie logistică binar prin validare încrucișată de zece ori și evaluarea performanței predictive în seturi de validare internă și externă.b Statistici de validare încrucișată a modelului de regresie LASSO pentru selecția biomarkerilor metabolici.Numerele date mai sus reprezintă numărul mediu de biomarkeri selectați la un λ dat.Linia punctată roșie reprezintă valoarea medie AUC la lambda corespunzătoare.Barele de eroare gri reprezintă valorile AUC minime și maxime.Linia punctată indică cel mai bun model cu cei 27 de biomarkeri selectați.AUC, aria sub curba caracteristicii de operare a receptorului (ROC).c Modificări de pliere a 27 de metaboliți selectați în grupul LA comparativ cu grupul BN din grupul descoperire.Coloana roșie – activare.Coloana albastră este un declin.d–f Curbele caracteristice de funcționare a receptorului (ROC) care arată puterea modelului discriminant bazat pe 27 de combinații de metaboliți în seturile de validare de descoperire, internă și externă.Datele sursă sunt furnizate sub formă de fișiere de date sursă.
A fost creat un model de predicție pe baza coeficienților de regresie ponderați ai acestor 27 de metaboliți (Tabelul suplimentar 3).Analiza ROC bazată pe acești 27 de metaboliți a dat o valoare a zonei sub curbă (AUC) de 0,933, sensibilitatea grupului de descoperire a fost 0,868 și specificitatea a fost 0,859 (Fig. 2d).Între timp, printre cei 38 de metaboliți diferențiali adnotați între LA și HC, un set de 16 metaboliți a atins o ASC de 0,902 cu o sensibilitate de 0,801 și o specificitate de 0,856 în discriminarea LA de HC (Figura suplimentară 6a-c).Au fost comparate, de asemenea, valorile ASC bazate pe diferite praguri de schimbare a orificiilor pentru metaboliții diferiți.Am constatat că modelul de clasificare s-a comportat cel mai bine în discriminarea dintre LA și BN (HC) atunci când nivelul de schimbare a orificiului a fost setat la 1,2 față de 1,5 sau 2,0 (Figura suplimentară 7a,b).Modelul de clasificare, bazat pe 27 de grupuri de metaboliți, a fost validat în continuare în cohorte interne și externe.AUC a fost de 0,915 (sensibilitate 0,867, specificitate 0,811) pentru validarea internă și 0,945 (sensibilitate 0,810, specificitate 0,979) pentru validarea externă (Fig. 2e, f).Pentru a evalua eficiența interlaboratoarelor, 40 de probe din cohorta externă au fost analizate într-un laborator extern, așa cum este descris în secțiunea Metode.Precizia clasificării a atins o AUC de 0,925 (Figura suplimentară 8).Deoarece carcinomul pulmonar cu celule scuamoase (LUSC) este al doilea cel mai frecvent subtip de cancer pulmonar fără celule mici (NSCLC) după adenocarcinomul pulmonar (LUAD), am testat, de asemenea, utilitatea potențială validată a profilurilor metabolice.BN și 16 cazuri de LUSC.AUC-ul discriminării dintre LUSC și BN a fost de 0,776 (Figura suplimentară 9), indicând o capacitate mai slabă în comparație cu discriminarea dintre LUAD și BN.
Studiile au arătat că dimensiunea nodulilor pe imaginile CT este corelată pozitiv cu probabilitatea de malignitate și rămâne un determinant major al tratamentului nodulilor25,26,27.Analiza datelor din cohorta mare a studiului de screening NELSON a arătat că riscul de malignitate la subiecții cu ganglioni <5 mm a fost chiar similar cu cel la subiecții fără ganglioni 28 .Prin urmare, dimensiunea minimă care necesită monitorizare CT regulată este de 5 mm, așa cum este recomandat de British Thoracic Society (BTS) și de 6 mm, așa cum este recomandat de Fleischner Society 29 .Cu toate acestea, nodulii mai mari de 6 mm și fără caracteristici benigne evidente, numiți noduli pulmonari nedeterminați (IPN), rămân o provocare majoră în evaluare și management în practica clinică30,31.În continuare, am examinat dacă dimensiunea nodulului a influențat semnăturile metabolomice utilizând mostre combinate din cohortele de descoperire și validare internă.Concentrându-ne pe 27 de biomarkeri validați, am comparat mai întâi profilurile PCA ale metabolomilor HC și BN sub-6 mm.Am constatat că majoritatea punctelor de date pentru HC și BN s-au suprapus, demonstrând că nivelurile metaboliților seric au fost similare în ambele grupuri (Fig. 3a).Hărțile caracteristicilor din diferite game de dimensiuni au rămas conservate în BN și LA (Fig. 3b, c), în timp ce a fost observată o separare între nodulii maligni și benini în intervalul 6-20 mm (Fig. 3d).Această cohortă a avut un ASC de 0,927, o specificitate de 0,868 și o sensibilitate de 0,820 pentru prezicerea malignității nodulilor care măsoară 6 până la 20 mm (Fig. 3e, f).Rezultatele noastre arată că clasificatorul poate surprinde modificările metabolice cauzate de transformarea malignă timpurie, indiferent de dimensiunea nodulilor.
ad Comparație a profilurilor PCA între grupuri specificate pe baza unui clasificator metabolic de 27 de metaboliți.CC și BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.în LA 6–20 mm față de LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm și LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Curba caracteristicii de funcționare a receptorului (ROC) care arată performanța modelului discriminant pentru nodulii 6–20 mm.f Valorile probabilității au fost calculate pe baza modelului de regresie logistică pentru nodulii care măsoară 6–20 mm.Linia punctată gri reprezintă valoarea limită optimă (0,455).Cifrele de mai sus reprezintă procentul de cazuri proiectate pentru Los Angeles.Utilizați un test t Student cu două cozi.PCA, analiza componentelor principale.Zona AUC sub curbă.Datele sursă sunt furnizate sub formă de fișiere de date sursă.
Patru probe (cu vârsta cuprinsă între 44-61 de ani) cu dimensiuni similare ale nodulilor pulmonari (7-9 mm) au fost selectate în continuare pentru a ilustra performanța modelului propus de predicție a malignității (Fig. 4a, b).La screening-ul inițial, Cazul 1 s-a prezentat ca un nodul solid cu calcifiere, o caracteristică asociată cu benignitate, în timp ce Cazul 2 s-a prezentat ca un nodul parțial solid nedeterminat, fără caracteristici benigne evidente.Trei runde de scanări CT de urmărire au arătat că aceste cazuri au rămas stabile pe o perioadă de 4 ani și, prin urmare, au fost considerate noduli benign (Fig. 4a).În comparație cu evaluarea clinică a scanărilor CT în serie, analiza metaboliților serici cu o singură injecție cu modelul actual de clasificare a identificat rapid și corect acești noduli benini pe baza constrângerilor probabilistice (Tabelul 1).Figura 4b în cazul 3 prezintă un nodul cu semne de retracție pleurală, care este cel mai adesea asociat cu malignitate32.Cazul 4 prezentat ca un nodul parțial solid nedeterminat, fără nicio dovadă a unei cauze benigne.Toate aceste cazuri au fost prezise ca maligne conform modelului de clasificare (Tabelul 1).Evaluarea adenocarcinomului pulmonar a fost demonstrată prin examen histopatologic după intervenția chirurgicală de rezecție pulmonară (Fig. 4b).Pentru setul de validare externă, clasificatorul metabolic a prezis cu exactitate două cazuri de noduli pulmonari nedeterminați mai mari de 6 mm (Figura suplimentară 10).
Imagini CT ale ferestrei axiale a plămânilor a două cazuri de noduli benign.În cazul 1, scanarea CT după 4 ani a evidențiat un nodul solid stabil de 7 mm cu calcifiere în lobul inferior drept.În cazul 2, scanarea CT după 5 ani a evidențiat un nodul stabil, parțial solid, cu un diametru de 7 mm în lobul superior drept.b Imagini CT cu fereastră axială ale plămânilor și studii patologice corespunzătoare a două cazuri de adenocarcinom stadiul I înainte de rezecția pulmonară.Cazul 3 a evidențiat un nodul cu diametrul de 8 mm în lobul superior drept cu retracție pleurală.Cazul 4 a dezvăluit un nodul de sticlă șlefuită parțial solid, care măsoară 9 mm în lobul superior stâng.Colorarea cu hematoxilină și eozină (H&E) a țesutului pulmonar rezecat (bară de scară = 50 μm) demonstrând modelul de creștere acinar al adenocarcinomului pulmonar.Săgețile indică noduli detectați pe imaginile CT.Imaginile H&E sunt imagini reprezentative ale câmpurilor microscopice multiple (>3) examinate de patolog.
Luate împreună, rezultatele noastre demonstrează valoarea potențială a biomarkerilor metaboliților serici în diagnosticul diferențial al nodulilor pulmonari, ceea ce poate reprezenta provocări atunci când se evaluează screening-ul CT.
Pe baza unui panou de metaboliți diferențiați validat, am căutat să identificăm corelațiile biologice ale modificărilor metabolice majore.Analiza de îmbogățire a căilor KEGG de către MetaboAnalyst a identificat 6 căi comune modificate semnificativ între cele două grupuri date (LA vs. HC și LA vs. BN, p ajustat ≤ 0,001, efect > 0,01).Aceste modificări au fost caracterizate prin tulburări în metabolismul piruvatului, metabolismul triptofanului, metabolismul niacinei și nicotinamidei, glicoliză, ciclul TCA și metabolismul purinelor (Fig. 5a).Apoi, am efectuat în continuare metabolomica țintită pentru a verifica modificările majore folosind cuantificarea absolută.Determinarea metaboliților comuni în căile modificate în mod obișnuit prin spectrometrie de masă cu triplu cvadrupol (QQQ) folosind standarde de metaboliți autentice.Caracteristicile demografice ale eșantionului țintă al studiului metabolomic sunt incluse în Tabelul suplimentar 4. În conformitate cu rezultatele noastre metabolomice globale, analiza cantitativă a confirmat că hipoxantină și xantină, piruvat și lactat au fost crescute în LA comparativ cu BN și HC (Fig. 5b, c, p <0,05).Cu toate acestea, nu au fost găsite diferențe semnificative în acești metaboliți între BN și HC.
Analiza de îmbogățire a căii KEGG a metaboliților semnificativ diferiți în grupul LA în comparație cu grupurile BN și HC.A fost utilizat un Globaltest cu două cozi, iar valorile p au fost ajustate folosind metoda Holm-Bonferroni (p ajustat ≤ 0,001 și dimensiunea efectului > 0,01).b–d Diagrame de vioară care arată nivelurile de hipoxantină, xantină, lactat, piruvat și triptofan în ser HC, BN și LA determinate prin LC-MS/MS (n = 70 per grup).Liniile punctate albe și negre indică mediana și, respectiv, quartila.e Graficul de vioară care arată expresia ARNm log2TPM (transcrieri per milion) normalizată a SLC7A5 și QPRT în adenocarcinomul pulmonar (n = 513) în comparație cu țesutul pulmonar normal (n = 59) în setul de date LUAD-TCGA.Caseta albă reprezintă intervalul intercuartil, linia neagră orizontală din centru reprezintă mediana, iar linia neagră verticală care se extinde din casetă reprezintă intervalul de încredere (IC) de 95%.f Graficul de corelație Pearson al expresiei SLC7A5 și GAPDH în adenocarcinomul pulmonar (n = 513) și țesutul pulmonar normal (n = 59) în setul de date TCGA.Zona gri reprezintă CI de 95%.r, coeficientul de corelație Pearson.g Nivelurile de triptofan celular normalizate în celulele A549 transfectate cu control shRNA nespecific (NC) și shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinate prin LC-MS/MS.Este prezentată analiza statistică a cinci probe biologic independente din fiecare grup.h Nivelurile celulare de NADt (NAD total, inclusiv NAD+ și NADH) în celulele A549 (NC) și celulele A549 de deplasare SLC7A5 (Sh1, Sh2).Este prezentată analiza statistică a trei probe biologic independente din fiecare grup.i Activitatea glicolitică a celulelor A549 înainte și după distrugerea SLC7A5 a fost măsurată prin rata de acidificare extracelulară (ECAR) (n = 4 probe biologic independente per grup).2-DG,2-deoxi-D-glucoză.Testul t Student cu două cozi a fost utilizat în (b–h).În (g–i), barele de eroare reprezintă media ± SD, fiecare experiment a fost efectuat de trei ori independent și rezultatele au fost similare.Datele sursă sunt furnizate sub formă de fișiere de date sursă.
Având în vedere impactul semnificativ al metabolismului alterat al triptofanului în grupul LA, am evaluat, de asemenea, nivelurile serice de triptofan în grupurile HC, BN și LA folosind QQQ.Am descoperit că triptofanul seric a fost redus în LA comparativ cu HC sau BN (p < 0,001, Figura 5d), ceea ce este în concordanță cu constatările anterioare conform cărora nivelurile circulante ale triptofanului sunt mai scăzute la pacienții cu cancer pulmonar decât la martorii sănătoși din grupul de control33,34. ,35.Un alt studiu care a folosit trasorul PET/CT 11C-metil-L-triptofan a constatat că timpul de retenție a semnalului triptofan în țesutul cancerului pulmonar a fost semnificativ crescut în comparație cu leziunile benigne sau cu țesutul normal36.Emitem ipoteza că scăderea triptofanului în serul LA poate reflecta absorbția activă a triptofanului de către celulele canceroase pulmonare.
De asemenea, se știe că produsul final al căii chinureninei a catabolismului triptofanului este NAD+37,38, care este un substrat important pentru reacția gliceraldehidei-3-fosfatului cu 1,3-bisfosfogliceratul în glicoliză39.În timp ce studiile anterioare s-au concentrat pe rolul catabolismului triptofanului în reglarea imună, am căutat să elucidam interacțiunea dintre dereglarea triptofanului și căile glicolitice observate în studiul actual.Se știe că familia de transportor de solut 7 membru 5 (SLC7A5) este un transportor de triptofan43,44,45.Fosforibosiltransferaza acidului chinolinic (QPRT) este o enzimă situată în aval de calea chinureninei care transformă acidul chinolinic în NAMN46.Inspecția setului de date LUAD TCGA a arătat că atât SLC7A5, cât și QPRT au fost reglate în mod semnificativ în țesutul tumoral în comparație cu țesutul normal (Fig. 5e).Această creștere a fost observată în stadiile I și II, precum și în stadiile III și IV ale adenocarcinomului pulmonar (Figura suplimentară 11), indicând tulburări precoce ale metabolismului triptofanului asociate cu tumorigeneză.
În plus, setul de date LUAD-TCGA a arătat o corelație pozitivă între expresia ARNm SLC7A5 și GAPDH în probele de pacienți cu cancer (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f).În schimb, nu a fost găsită o corelație semnificativă între astfel de semnături de gene în țesutul pulmonar normal (r = 0,25, p = 0,06, Figura 5f).Eliminarea SLC7A5 (Figura suplimentară 12) în celulele A549 a redus semnificativ nivelurile de triptofan celular și NAD(H) (Figura 5g, h), rezultând o activitate glicolitică atenuată, măsurată prin rata de acidificare extracelulară (ECAR) (Figura 1).5i).Astfel, pe baza modificărilor metabolice în ser și a detectării in vitro, emitem ipoteza că metabolismul triptofanului poate produce NAD+ prin calea chinureninei și joacă un rol important în promovarea glicolizei în cancerul pulmonar.
Studiile au arătat că un număr mare de noduli pulmonari nedeterminați detectați prin LDCT poate duce la necesitatea unor teste suplimentare, cum ar fi PET-CT, biopsie pulmonară și supratratament din cauza unui diagnostic fals pozitiv de malignitate.31 După cum se arată în Figura 6, Studiul nostru a identificat un panou de metaboliți serici cu valoare de diagnostic potențială care poate îmbunătăți stratificarea riscului și gestionarea ulterioară a nodulilor pulmonari detectați prin CT.
Nodulii pulmonari sunt evaluați folosind tomografie computerizată cu doze mici (LDCT) cu caracteristici imagistice care sugerează cauze benigne sau maligne.Rezultatul incert al nodulilor poate duce la vizite frecvente de urmărire, intervenții inutile și supratratament.Includerea clasificatorilor metabolici seric cu valoare diagnostică poate îmbunătăți evaluarea riscului și gestionarea ulterioară a nodulilor pulmonari.Tomografie PET cu emisie de pozitroni.
Datele din studiul NLST din SUA și din studiul european NELSON sugerează că screeningul grupurilor cu risc ridicat cu tomografie computerizată cu doze mici (LDCT) poate reduce mortalitatea prin cancer pulmonar1,3.Cu toate acestea, evaluarea riscului și gestionarea clinică ulterioară a unui număr mare de noduli pulmonari incidentali detectați prin LDCT rămân cele mai dificile.Scopul principal este de a optimiza clasificarea corectă a protocoalelor existente bazate pe LDCT prin încorporarea biomarkerilor de încredere.
Anumiți biomarkeri moleculari, cum ar fi metaboliții din sânge, au fost identificați prin compararea cancerului pulmonar cu martori sănătoși15,17.În studiul actual, ne-am concentrat pe aplicarea analizei metabolomice serice pentru a distinge între nodulii pulmonari benini și maligni detectați incidental de LDCT.Am comparat metabolomul seric global al martorului sănătos (HC), nodulii pulmonari benini (BN) și probele de adenocarcinom pulmonar (LA) stadiul I utilizând analiza UPLC-HRMS.Am descoperit că HC și BN au profiluri metabolice similare, în timp ce LA a prezentat modificări semnificative în comparație cu HC și BN.Am identificat două seturi de metaboliți serici care diferențiază LA de HC și BN.
Schema actuală de identificare bazată pe LDCT pentru nodulii benini și maligni se bazează în principal pe dimensiunea, densitatea, morfologia și rata de creștere a nodulilor în timp30.Studiile anterioare au arătat că dimensiunea nodulilor este strâns legată de probabilitatea de cancer pulmonar.Chiar și la pacienții cu risc ridicat, riscul de malignitate în ganglionii <6 mm este <1%.Riscul de malignitate pentru nodulii care măsoară 6 până la 20 mm variază de la 8% la 64%30.Prin urmare, Societatea Fleischner recomandă un diametru de tăiere de 6 mm pentru urmărirea CT de rutină.29 Cu toate acestea, evaluarea riscului și managementul nodulilor pulmonari nedeterminați (IPN) mai mari de 6 mm nu au fost efectuate în mod adecvat 31 .Managementul actual al bolii cardiace congenitale se bazează de obicei pe așteptarea atentă cu monitorizare CT frecventă.
Pe baza metabolomului validat, am demonstrat pentru prima dată suprapunerea semnăturilor metabolomice dintre indivizii sănătoși și nodulii benigni <6 mm.Similitudinea biologică este în concordanță cu constatările CT anterioare conform cărora riscul de malignitate pentru nodulii <6 mm este la fel de scăzut ca și pentru subiecții fără ganglioni.30 Trebuie remarcat faptul că rezultatele noastre demonstrează, de asemenea, că nodulii benigni <6 mm și ≥6 mm au asemănarea profilurilor metabolomice, sugerând că definiția funcțională a etiologiei benigne este consecventă indiferent de dimensiunea nodulului.Astfel, panourile moderne de diagnosticare a metaboliților serici pot oferi un singur test ca test de excludere atunci când nodulii sunt detectați inițial pe CT și pot reduce monitorizarea în serie.În același timp, același grup de biomarkeri metabolici a distins nodulii maligni cu dimensiunea ≥6 mm de nodulii benigni și a oferit predicții precise pentru IPN de dimensiuni similare și caracteristici morfologice ambigue pe imaginile CT.Acest clasificator al metabolismului seric a avut rezultate bune în prezicerea malignității nodulilor ≥6 mm cu o ASC de 0,927.Luate împreună, rezultatele noastre indică faptul că semnăturile metabolomice serice unice pot reflecta în mod specific modificările metabolice precoce induse de tumoră și pot avea o valoare potențială ca predictori de risc, independent de dimensiunea nodulului.
În special, adenocarcinomul pulmonar (LUAD) și carcinomul cu celule scuamoase (LUSC) sunt principalele tipuri de cancer pulmonar cu celule non-mici (NSCLC).Având în vedere că LUSC este puternic asociat cu consumul de tutun47 și LUAD este cea mai comună histologie a nodulilor pulmonari incidentali detectați la screening-ul CT48, modelul nostru de clasificare a fost construit special pentru probele de adenocarcinom stadiul I.Wang și colegii s-au concentrat, de asemenea, pe LUAD și au identificat nouă semnături lipidice folosind lipidomica pentru a distinge cancerul pulmonar în stadiu incipient de persoanele sănătoase17.Am testat modelul actual de clasificare pe 16 cazuri de LUSC stadiul I și 74 de noduli benini și am observat o precizie scăzută a predicției LUSC (AUC 0,776), sugerând că LUAD și LUSC pot avea propriile semnături metabolomice.Într-adevăr, LUAD și LUSC s-au dovedit a fi diferite în ceea ce privește etiologie, origine biologică și aberații genetice49.Prin urmare, alte tipuri de histologie ar trebui incluse în modelele de instruire pentru detectarea pe bază de populație a cancerului pulmonar în programele de screening.
Aici, am identificat cele șase căi cel mai frecvent modificate în adenocarcinomul pulmonar în comparație cu martorii sănătoși și nodulii benign.Xantina și hipoxantina sunt metaboliți comuni ai căii metabolice ale purinelor.În concordanță cu rezultatele noastre, intermediarii asociați cu metabolismul purinelor au fost semnificativ crescute în serul sau țesuturile pacienților cu adenocarcinom pulmonar în comparație cu martorii sănătoși sau pacienții aflați în stadiul preinvaziv15,50.Nivelurile serice crescute de xantină și hipoxantină pot reflecta anabolismul necesar de celulele canceroase cu proliferare rapidă.Dereglarea metabolismului glucozei este un semn distinctiv binecunoscut al metabolismului cancerului51.Aici, am observat o creștere semnificativă a piruvatului și a lactatului în grupul LA în comparație cu grupul HC și BN, ceea ce este în concordanță cu rapoartele anterioare ale anomaliilor căii glicolitice în profilurile metabolomului seric ale pacienților cu cancer pulmonar fără celule mici (NSCLC) și controale sănătoase.rezultatele sunt consistente52,53.
Foarte important, am observat o corelație inversă între metabolismul piruvatului și al triptofanului în serul adenocarcinoamelor pulmonare.Nivelurile serice de triptofan au fost reduse în grupul LA comparativ cu grupul HC sau BN.Interesant este că un studiu anterior la scară largă, folosind o cohortă prospectivă, a constatat că nivelurile scăzute de triptofan circulant au fost asociate cu un risc crescut de cancer pulmonar 54 .Triptofanul este un aminoacid esențial pe care îl obținem în întregime din alimente.Concluzionăm că epuizarea triptofanului seric în adenocarcinomul pulmonar poate reflecta epuizarea rapidă a acestui metabolit.Este bine cunoscut faptul că produsul final al catabolismului triptofanului prin calea chinureninei este sursa sintezei de novo NAD+.Deoarece NAD+ este produs în principal prin calea de salvare, importanța NAD+ în metabolismul triptofanului în sănătate și boală rămâne de determinat46.Analiza noastră a bazei de date TCGA a arătat că expresia transportorului dizolvat al transportorului de triptofan 7A5 (SLC7A5) a fost semnificativ crescută în adenocarcinomul pulmonar în comparație cu martorii normali și a fost corelată pozitiv cu expresia enzimei glicolitice GAPDH.Studiile anterioare s-au concentrat în principal pe rolul catabolismului triptofanului în suprimarea răspunsului imun antitumoral40,41,42.Aici demonstrăm că inhibarea absorbției triptofanului prin distrugerea SLC7A5 în celulele cancerului pulmonar are ca rezultat o scădere ulterioară a nivelurilor de NAD celular și o atenuare concomitentă a activității glicolitice.În rezumat, studiul nostru oferă o bază biologică pentru modificările metabolismului seric asociate cu transformarea malignă a adenocarcinomului pulmonar.
Mutațiile EGFR sunt cele mai frecvente mutații conducătoare la pacienții cu NSCLC.În studiul nostru, am constatat că pacienții cu mutație EGFR (n = 41) au avut profiluri metabolomice generale similare cu pacienții cu EGFR de tip sălbatic (n = 31), deși am găsit niveluri serice scăzute ale unor pacienți mutanți EGFR la pacienții cu acilcarnitină.Funcția stabilită a acilcarnitinelor este de a transporta grupările acil din citoplasmă în matricea mitocondrială, ducând la oxidarea acizilor grași pentru a produce energie 55 .În concordanță cu constatările noastre, un studiu recent a identificat, de asemenea, profiluri similare de metabolom între mutanții EGFR și tumorile de tip sălbatic EGFR, analizând metabolomul global din 102 mostre de țesut de adenocarcinom pulmonar50.Interesant, conținutul de acilcarnitină a fost găsit și în grupul de mutanți EGFR.Prin urmare, dacă modificările nivelurilor de acilcarnitină reflectă modificări metabolice induse de EGFR și căile moleculare subiacente ar putea merita un studiu suplimentar.
În concluzie, studiul nostru stabilește un clasificator metabolic seric pentru diagnosticul diferențial al nodulilor pulmonari și propune un flux de lucru care poate optimiza evaluarea riscului și facilita managementul clinic bazat pe screening-ul CT.
Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de etică al Spitalului de Cancer al Universității Sun Yat-sen, Primul Spital Afiliat al Universității Sun Yat-sen și Comitetul de Etică al Spitalului de Cancer al Universității Zhengzhou.În grupurile de descoperire și validare internă, 174 de seruri de la indivizi sănătoși și 244 de seruri de la noduli benigni au fost colectate de la persoane supuse unor examinări medicale anuale la Departamentul de Control și Prevenire a Cancerului, Centrul de Cancer al Universității Sun Yat-sen și 166 de noduli benini.ser.Adenocarcinoamele pulmonare în stadiul I au fost colectate de la Centrul de Cancer al Universității Sun Yat-sen.În cohorta de validare externă, au existat 48 de cazuri de noduli benign, 39 de cazuri de adenocarcinom pulmonar în stadiul I de la Primul Spital Afiliat al Universității Sun Yat-sen și 24 de cazuri de adenocarcinom pulmonar în stadiul I de la Spitalul de Cancer Zhengzhou.Centrul de Cancer al Universității Sun Yat-sen a colectat, de asemenea, 16 cazuri de cancer pulmonar cu celule scuamoase în stadiul I pentru a testa capacitatea de diagnosticare a clasificatorului metabolic stabilit (caracteristicile pacientului sunt prezentate în Tabelul suplimentar 5).Eșantioane din cohorta de descoperire și cohorta de validare internă au fost colectate între ianuarie 2018 și mai 2020. Probe pentru cohorta de validare externă au fost colectate între august 2021 și octombrie 2022. Pentru a minimiza prejudecățile de gen, fiecăruia au fost atribuite un număr aproximativ egal de cazuri de bărbați și femei. cohortă.Echipa de descoperire și echipa de evaluare internă.Sexul participantului a fost determinat pe baza auto-raportului.A fost obținut consimțământul informat de la toți participanții și nu a fost oferită nicio compensație.Subiecții cu noduli benigni au fost cei cu un scor CT stabil la 2 până la 5 ani la momentul analizei, cu excepția unui caz din proba de validare externă, care a fost recoltat preoperator și diagnosticat histopatologic.Cu excepția bronșitei cronice.Cazurile de adenocarcinom pulmonar au fost colectate înainte de rezecția pulmonară și confirmate prin diagnostic patologic.Probele de sânge a jeun au fost colectate în tuburi de separare a serului fără anticoagulante.Probele de sânge au fost coagulate timp de 1 oră la temperatura camerei și apoi centrifugate la 2851 x g timp de 10 minute la 4°C pentru a colecta supernatantul seric.Alicotele de ser au fost congelate la -80°C până la extragerea metabolitului.Departamentul de Prevenire a Cancerului și Examinare Medicală a Centrului de Cancer al Universității Sun Yat-sen a colectat un bazin de ser de la 100 de donatori sănătoși, inclusiv un număr egal de bărbați și femei cu vârsta cuprinsă între 40 și 55 de ani.Au fost amestecate volume egale din fiecare probă donor, amestecul rezultat a fost împărțit și depozitat la -80°C.Amestecul de ser a fost folosit ca material de referință pentru controlul calității și standardizarea datelor.
Serul de referință și probele de testare au fost dezghețate și metaboliții au fost extrași folosind o metodă de extracție combinată (MTBE/metanol/apă) 56 .Pe scurt, 50 μl de ser au fost amestecați cu 225 μl de metanol rece ca gheața și 750 μl de metil terț-butil eter (MTBE) rece ca gheață.Se amestecă amestecul și se incubează pe gheață timp de 1 oră.Probele au fost apoi amestecate și amestecate în vortex cu 188 μl de apă de grad MS care conține standarde interne (13C-lactat, 13C3-piruvat, 13C-metionină și 13C6-izoleucină, achiziționate de la Cambridge Isotope Laboratories).Amestecul a fost apoi centrifugat la 15.000 × g timp de 10 minute la 4 ° C, iar faza inferioară a fost transferată în două tuburi (125 μL fiecare) pentru analiza LC-MS în mod pozitiv și negativ.În cele din urmă, proba a fost evaporată până la uscare într-un concentrator cu vid de mare viteză.
Metaboliții uscați au fost reconstituiți în 120 μl de acetonitril 80%, agitați în vortex timp de 5 minute și centrifugați la 15.000 × g timp de 10 minute la 4°C.Supernatanții au fost transferați în flacoane de sticlă chihlimbar cu microinserții pentru studii metabolomice.Analiză metabolomică nețintă pe o platformă de cromatografie lichidă ultra-performanță-spectrometrie de masă de înaltă rezoluție (UPLC-HRMS).Metaboliții au fost separați folosind un sistem Dionex Ultimate 3000 UPLC și o coloană ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).În modul ion pozitiv, fazele mobile au fost 95% (A) și 50% acetonitril (B), fiecare conținând 10 mmol/L acetat de amoniu și 0,1% acid formic.În modul negativ, fazele mobile A și B au conținut 95% și respectiv 50% acetonitril, ambele faze au conținut 10 mmol/L acetat de amoniu, pH = 9. Programul de gradient a fost următorul: 0–0,5 min, 2% B;0,5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16,1–20 min, 2% B. Coloana a fost menținută la 40°C și proba la 10°C în autosampler.Debitul a fost de 0,3 ml/min, volumul de injectare a fost de 3 μl.Un spectrometru de masă Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) cu o sursă de ionizare electrospray (ESI) a fost operat în modul de scanare completă și cuplat cu modul de monitorizare ddMS2 pentru a colecta volume mari de date.Parametrii MS au fost setați după cum urmează: tensiune de pulverizare +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura capilară 320°C, gaz de protecție 40 arb, gaz auxiliar 10 arb, temperatura încălzitorului sondei 350°C, interval de scanare 70–1050 m/h, rezoluţie.70 000. Datele au fost obținute folosind Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Pentru a evalua calitatea datelor, au fost generate probe de control al calității (QC) grupate prin îndepărtarea alicotelor de 10 μL de supernatant din fiecare probă.La începutul secvenței analitice au fost analizate șase injecții de probe de control al calității pentru a evalua stabilitatea sistemului UPLC-MS.Probele de control al calității sunt apoi introduse periodic în lot.Toate cele 11 loturi de probe de ser din acest studiu au fost analizate prin LC-MS.Alicote dintr-un amestec de ser de la 100 de donatori sănătoși au fost utilizate ca material de referință în loturile respective pentru a monitoriza procesul de extracție și a ajusta pentru efectele lot la lot.Analiza metabolomică nețintă a cohortei de descoperire, a cohortei de validare internă și a cohortei de validare externă a fost efectuată la Centrul de Metabolomică al Universității Sun Yat-sen.Laboratorul extern al Centrului de Analiză și Testare a Universității de Tehnologie din Guangdong a analizat, de asemenea, 40 de mostre din cohorta externă pentru a testa performanța modelului de clasificator.
După extracție și reconstituire, cuantificarea absolută a metaboliților serici a fost măsurată utilizând cromatografie lichidă de ultra-înaltă performanță-spectrometrie de masă în tandem (Agilent 6495 triplu quadrupol) cu o sursă de ionizare electrospray (ESI) în modul de monitorizare a reacțiilor multiple (MRM).O coloană ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) a fost utilizată pentru a separa metaboliții.Faza mobilă a constat din 90% (A) și 5% acetonitril (B) cu 10 mmol/L acetat de amoniu și soluție de amoniac 0,1%.Programul de gradient a fost următorul: 0–1,5 min, 0% B;1,5–6,5 min, 0–15% B;6,5–8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0%B.Coloana a fost menținută la 40 °C și proba la 10 °C în autosampler.Debitul a fost de 0,3 ml/min și volumul de injecție a fost de 1 μL.Parametrii MS au fost stabiliți după cum urmează: tensiune capilară ± 3,5 kV, presiunea nebulizatorului 35 psi, debitul gazului învelișului 12 L/min, temperatura gazului învelișului 350°C, temperatura gazului de uscare 250°C și debitul gazului de uscare 14 l/min.Conversiile MRM de triptofan, piruvat, lactat, hipoxantină și xantină au fost 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 și 151,0–107.9 respectiv.Datele au fost colectate folosind Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Pentru probele de ser, triptofan, piruvat, lactat, hipoxantină și xantină au fost cuantificate folosind curbele de calibrare ale soluțiilor de amestec standard.Pentru probele de celule, conținutul de triptofan a fost normalizat la standardul intern și masa proteinei celulare.
Extracția de vârf (m/z și timpul de retenție (RT)) a fost efectuată utilizând Compound Discovery 3.1 și TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Pentru a elimina diferențele potențiale dintre loturi, fiecare vârf caracteristic al probei de testat a fost împărțit la vârful caracteristic al materialului de referință din același lot pentru a obține abundența relativă.Abaterile standard relative ale standardelor interne înainte și după standardizare sunt prezentate în Tabelul suplimentar 6. Diferențele dintre cele două grupuri au fost caracterizate prin rata de descoperire falsă (FDR<0,05, testul de rang cu semnul Wilcoxon) și schimbarea ori (>1,2 sau <0,83).Datele MS brute ale caracteristicilor extrase și datele MS corectate cu ser de referință sunt afișate în Datele suplimentare 1 și, respectiv, Datele suplimentare 2.Adnotarea de vârf a fost efectuată pe baza a patru niveluri definite de identificare, inclusiv metaboliți identificați, compuși adnotați presupus, clase de compuși caracterizate presupus și compuși necunoscuți 22 .Pe baza căutărilor în baza de date în Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), compușii biologici cu standarde validate care corespund MS/MS sau adnotări de potrivire exactă în mzCloud (scor > 85) sau Chemspider au fost în cele din urmă selectați ca intermediari între metabolomul diferenţial.Adnotările de vârf pentru fiecare caracteristică sunt incluse în Datele suplimentare 3. MetaboAnalyst 5.0 a fost utilizat pentru analiza univariată a abundenței metaboliților normalizați în sumă.MetaboAnalyst 5.0 a evaluat, de asemenea, analiza de îmbogățire a căii KEGG pe baza metaboliților semnificativ diferiți.Analiza componentelor principale (PCA) și analiza discriminantă a celor mai mici pătrate parțiale (PLS-DA) au fost analizate folosind pachetul software ropls (v.1.26.4) cu normalizare stivă și autoscaling.Modelul optim de biomarker al metaboliților pentru prezicerea malignității nodulilor a fost generat utilizând regresia logistică binară cu operator de selecție și contracție minimă absolută (LASSO, pachetul R v.4.1-3).Performanța modelului discriminant în seturile de detectare și validare a fost caracterizată prin estimarea AUC pe baza analizei ROC conform pachetului pROC (v.1.18.0.).Limita optimă de probabilitate a fost obținută pe baza indicelui Youden maxim al modelului (sensibilitate + specificitate – 1).Probele cu valori mai mici sau mai mari decât pragul vor fi prezise ca noduli benini și, respectiv, adenocarcinom pulmonar.
Celulele A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) au fost crescute în mediu F-12K conţinând 10% FBS.Secvențe scurte de ARN (shRNA) care vizează SLC7A5 și un control non-targeting (NC) au fost inserate în vectorul lentiviral pLKO.1-puro.Secvențele antisens ale shSLC7A5 sunt după cum urmează: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Anticorpii la SLC7A5 (#5347) și tubulină (#2148) au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology.Anticorpii la SLC7A5 și tubulină au fost utilizați la o diluție de 1:1000 pentru analiza Western blot.
Testul de stres glicolitic Seahorse XF măsoară nivelurile de acidificare extracelulară (ECAR).În test, glucoza, oligomicină A și 2-DG au fost administrate secvenţial pentru a testa capacitatea glicolitică celulară măsurată prin ECAR.
Celulele A549 transfectate cu control non-țintire (NC) și shSLC7A5 (Sh1, Sh2) au fost placate peste noapte în vase cu diametrul de 10 cm.Metaboliții celulari au fost extrași cu 1 ml de metanol apos 80% rece ca gheață.Celulele din soluția de metanol au fost răzuite, colectate într-un tub nou și centrifugate la 15.000 × g timp de 15 minute la 4°C.Se colectează 800 µl de supernatant și se usucă folosind un concentrator cu vid de mare viteză.Peletele de metaboliți uscate au fost apoi analizate pentru nivelurile de triptofan utilizând LC-MS/MS așa cum este descris mai sus.Nivelurile celulare de NAD(H) din celulele A549 (NC și shSLC7A5) au fost măsurate folosind un kit colorimetric cantitativ NAD+/NADH (#K337, BioVision) conform instrucțiunilor producătorului.Nivelurile de proteine au fost măsurate pentru fiecare probă pentru a normaliza cantitatea de metaboliți.
Nu au fost utilizate metode statistice pentru a determina preliminar dimensiunea eșantionului.Studiile metabolomice anterioare care vizează descoperirea biomarkerilor15,18 au fost considerate ca repere pentru determinarea mărimii și, în comparație cu aceste rapoarte, eșantionul nostru a fost adecvat.Nu au fost excluse mostre din cohorta de studiu.Probele de ser au fost repartizate aleatoriu unui grup de descoperire (306 cazuri, 74,6%) și unui grup de validare internă (104 cazuri, 25,4%) pentru studii metabolomice nețintite.De asemenea, am selectat aleatoriu 70 de cazuri din fiecare grup din setul de descoperiri pentru studii metabolomice țintite.Anchetatorii au fost orbiți față de repartizarea grupului în timpul colectării și analizei datelor LC-MS.Analizele statistice ale datelor metabolomice și ale experimentelor cu celule sunt descrise în secțiunile respective Rezultate, Legende figuri și Metode.Cuantificarea triptofanului celular, NADT și activității glicolitice a fost efectuată de trei ori independent, cu rezultate identice.
Pentru mai multe informații despre designul studiului, consultați rezumatul raportului Natural Portfolio asociat cu acest articol.
Datele MS brute ale caracteristicilor extrase și datele MS normalizate ale serului de referință sunt afișate în Datele suplimentare 1 și, respectiv, Datele suplimentare 2.Adnotările de vârf pentru caracteristicile diferențiale sunt prezentate în Datele suplimentare 3. Setul de date LUAD TCGA poate fi descărcat de pe https://portal.gdc.cancer.gov/.Datele de intrare pentru trasarea graficului sunt furnizate în datele sursă.Datele sursă sunt furnizate pentru acest articol.
National Lung Screening Study Group, etc. Reducerea mortalității prin cancer pulmonar cu tomografie computerizată cu doze mici.Nordul Angliei.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR și Prophet, PC Screeningul cancerului pulmonar folosind CT elicoidal cu doze mici: rezultate din Studiul național de screening pulmonar (NLST).J. Med.Ecranul 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Reducerea mortalității prin cancer pulmonar cu screening CT volumetric într-un studiu randomizat.Nordul Angliei.J. Med.382, 503–513 (2020).
Ora postării: 18-sept-2023